三个dna片段的酶切连接

DNA 凝胶回收试剂盒

产品简介：

DNA 凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)，是一种用于从 DNA琼脂糖凝胶中回收目的 DNA 的试剂盒。本试剂盒采用优化的缓冲体系和可高效、专一性吸附 DNA 的硅胶柱，从 TAE 或 TBE 琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段，通过离心力或者负压让含有核酸的溶液通过硅胶膜，使核酸在特定溶液环境中吸附在硅胶膜上，经过洗涤、洗脱等步骤得到纯的核酸。纯化的 DNA 可直接用于连接、转化、酶切、PCR、 测序、文库筛选等分子生物学研究。

产品内容：

储存条件：

使用前请先在漂洗液 Buffer PW 中加入 12 mL 无水乙醇。

１．将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取凝胶重量（去除空管重量），100 mg凝胶等同于 100 μL 体积，作为一个凝胶体积。

注：若回收的 DNA 片段用于克隆，须避免紫外照射损伤 DNA。尽量减少紫外暴露时间。

２．向胶块中加入 1 倍体积 Buffer PE（如果凝胶重为 0.1 g，则加入100 µL Buffer PE）。50-60℃水浴溶胶 5-10 min，期间温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块。）

３．将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，室温放置 1 min，12,000rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

注：吸附柱的容量为 750 µL，若上步得到的溶液大于 750 µL，可分批加入。

４．在吸附柱中加入 300 µL Buffer PE，12,000 rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

５．在吸附柱中加入 700 µL Buffer PW（确认已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

６．重复一次步骤 5。

７．吸附柱放回收集管后，12,000 rpm 离心 2 min，尽量除尽漂洗液。

注意：可将吸附柱置于室温放置数分钟，以防止残留的乙醇影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。

８．将吸附柱放入干净的 1.5 mL 离心管中，开盖室温静置 5 min。向吸附膜中间位置加入 30 µL Buffer PB 或 ddH2O（洗脱液应先放置于水浴锅中预热） ，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，收集DNA 溶液。

注意：洗脱体积不应小于 30 μl，体积过少影响回收效率。为了提高 DNA 的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，12,000 rpm 离心 2 min，将DNA 溶液收集到离心管中。回收大于 3 KB 的片段时，建议将 Buffer PB 预热至55 ℃以提升回收效率。DNA 也可以用 ddH2O 洗脱。DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。

麻殃董2682单酶切和双酶切的定义分别是什么?它们有什么不同?做实验的时候要把400bp目的片断连到pcDNA3.1(+)质粒中去:单酶切质粒后用T4 DNA连接酶连接... -
耿雨垂18415848910 ______[答案] 单酶切就是只用一个限制性内切酶去切你的质粒,环状的质粒就成为线状的了,但质粒的大小不变双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒就变成两段线状DNA了.回收你需要的那一段,因为它的两端和你的目...

麻殃董2682要配置多少的酶切体系,载体和插入DNA的量要加多少? -
耿雨垂18415848910 ______[答案] 因为内切酶的酶活性单位定义是在50ul反应体系中,最适温度反应1小时能够讲1ugDNA完全酶切的酶量.所以,一般在酶切体系里,DNA的量是可以加到非常大的.因为考虑到后期的纯化后DNA的损失问题,所以推荐酶切体系中的DNA尽量多加一些....

麻殃董2682如图为某种质粒表达载体简图,小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点,ampR为青霉素抗性基 -
耿雨垂18415848910 ______ (1)由于含有目的基因的DNA片段和质粒上均含有EcoRI酶的切割位点,所以用此酶切割后产生相同的黏性末端.这样,具有相同黏性末端的片段用DNA连接酶均可连接,从而产生3种连接产物,目的基因-载体连接物、载体-载体连接物、目的基因-...

麻殃董2682酶切后形成 片段数? -
耿雨垂18415848910 ______ 这类题目不难. 最关键的是,要正确找到该酶的酶切位点,即特定的碱基序列.如果,没有酶的酶切位点,那么这种酶就不能对DNA分子起作用. 如果,是环形DNA分子,有几个酶切位点,就会被切成几段. 如果,是线性DNA分子,N种酶去切(都有酶切位点),就会形成(N+1)个DNA片段. ——————————————————————————————————— 对楼上的更正: DNA分子中,碱基之间的键是氢键,不是共价键.断开氢键,根本不需要酶切. 酶切开的是,磷酸基团与脱氧核糖之间的3',5'-磷酸二酯键,而不是什么氢键. 本人,研究生阶段做的就是基因工程. 楼主,如果还有什么不明白的地方,欢迎随时来问.

麻殃董2682为了解基因结构,通常选取一特定长度的线性DNA分子,先用一种限制酶切割,通过电泳技术将单酶水解片段分 -
耿雨垂18415848910 ______ (1)设计实验的基本原则要有对照实验,. (2)A酶切割后形成4段,所以有3个识别位点,B酶切割后形成3段,所以有2个切割位点. (3)由表中酶切割后片段长度可知,1900+600=2500,800+500=1300,1000+200=1200,所以连接如图所示. . ...

麻殃董2682DNA是双链的,那么它被切为2段,有几个酶切位点 -
耿雨垂18415848910 ______ 要是环状DNA就有两个酶切位点,要是线性DNA就有一个酶切位点,对于二型限制性内切酶切点与酶切位点是一样的,一,三型的有识别位点与切割位点是不同的.

麻殃董268233、酶切图谱是描述限制性内切酶的酶切点的位置和距离信息的图谱,通常选取某一特定长度的DNA分子,用多 -
耿雨垂18415848910 ______ (1)限制酶BamHⅠ与BstⅠ能识别相同的核苷酸序列,而且切点相同;BamHI与BglⅡ识别的核苷酸序列不同,但能产生相同的黏性末端作.黏性末端 重组的DNA序列为GGATCT∥CCTAGG,而限制酶BglⅡ的识别序列为AGATCT∥...

麻殃董2682图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点,ampr表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性 -
耿雨垂18415848910 ______ A、图甲中的质粒只有一个BamHⅠ切割位点,切割后形成一个直链DNA,含2个游离的磷酸基团,A错误;B、BamHⅠ切割位点在目的基因上,不能用该酶切割外源DNA,B错误;C、用PstⅠ和HindⅢ酶切质粒切成两个片段,用PstⅠ和HindⅢ酶能将外源DNA切成三段,只有含目的基因的片段通过DNA连接酶与质粒连接形成的重组质粒符合要求,而另一个重组质粒无目的基因,不符合要求,从而保证重组DNA序列的唯一性,C正确;D、导入目的基因的大肠杆菌,其重组质粒是用PstⅠ和HindⅢ酶切割的,其中的Ampr(氨苄青霉素抗性基因)已被破坏,D错误. 故选:C.

麻殃董2682有关基因工程的基本工具的几个简答题.1.从结构上分析,为什么不同生物的DNA能够重组?2.限制酶存在于原核生物中的作用?3.限制酶、DNA链接酶、DNA... -
耿雨垂18415848910 ______[答案] 1.都是核苷酸 2.切其他病菌DNA以保护自己 3.限制酶是切 DNA链接酶 连接片段 DNA聚合酶 组成片段 解旋酶 解开双螺旋

麻殃董2682图为某种质粒表达载体简图,小箭头所指分别 -
耿雨垂18415848910 ______ (1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切,酶切产物用DNA连接酶进行连接后,其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有(目的基因与目的基因 )、(目的基因与载体 )、(载体和载体) 三种.若要从这些连接产物中分离出重组质粒,需要对这些连接产物进行分离纯化 .(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验.之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中,能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 【载体自连接】 ;若接种到含青霉素的培养基中,能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是(目的基因与载体 ).