临床药理学重点总结
失眠是最常见的睡眠障碍，根据中国社会科学院的年度睡眠报告，近3/4的人群曾有过睡眠困扰。四神丸 (SSW) 是一种来用于治疗腹泻病的中药复方，肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、大枣组成。因其由多种具有神经活性的中药组成，临床实践中发现其对失眠也有治疗作用。军事医学科学院毒物药物研究所张有志团队利用临床前模型评价了四神丸的抗失眠作用并探讨了其可能的治病机制。
原名：Network pharmacology and pharmacological evaluation for deciphering novel indication of Sishen Wan in insomnia treatment
译名：四神丸治疗失眠的网络药理学研究及药理评价
期刊：Phytomedicine
影响因子：7.9 Q1
发文时间：2022.10.11
通讯作者：张有志
实验设计
使用网络药理学分析研究 SSW 配方的镇静作用；
使用各种药理学方法验证其对失眠的治疗效果，包括在正常大鼠中运动活动 (LMA) 的评估、戊巴比妥诱导的睡眠时间记录和基于脑电图/肌电图 (EEG/EMG) 的睡眠分析。
应用几种失眠动物模型，包括睡眠剥夺、血清素耗竭和换笼模型以进一步评估 SSW 的抗失眠作用。
此外，使用生物信息学方法预测了 SSW 潜在的作用机制，并使用计算机实验和体内实验对其进行验证。
主要研究结果
SSW治疗失眠的网络药理学分析
使用MS 系统鉴定了 SSW 水醇提取物中共 86 种化学成分。结合MS系统检测的化学谱和现有数据库收集的化学谱，得到SSW中的262个化合物。从多个据库收集了536个潜在的失眠相关靶基因。使用VENNY 2.0.2软件总共鉴定了116个与失眠和SSW相关的基因（图1A）。
使用 cytoHubba 筛选Hub基因，并鉴定了70个基因（图1B）。消除重叠的化合物和蛋白质后，SSW 中的 186 种化合物与 70 个中心目标相关。然后利用 186 种化合物及其相应靶标建立了中药化合物-靶标疾病网络（图1C）。
图 1. SSW的网络药理学分析、药物靶点和疾病相关蛋白质的维恩图（紫色圆圈代表SSW目标，黄色圆圈代表失眠目标，交互圆圈代表共同目标）
SSW对运动活力和戊巴比妥诱导的睡眠的影响
SSW具有剂量依赖性的镇静催眠作用。同时，该团队发现4.4 g/kg是SSW治疗失眠的最佳剂量，并且SSW在此剂量下取得了与地西泮相当的镇静效果。
为了探讨SSW对中枢神经系统的抑制作用，对正常小鼠进行了运动活力测试，与对照组相比，SSW组小鼠的过格数和站立数显著降低，地西泮治疗显示出类似的效果。
图 2. SSW 对戊巴比妥诱导睡眠的催眠作用、小鼠自主活动测试、自由活动大鼠睡眠特征分析及测量睡眠潜伏期 。
SSW对自由活动大鼠睡眠调节的影响
无线脑电图记录和分析验证了SSW对睡眠调节的影响。SSW和地西泮显著增加了总睡眠时间及NREM睡眠时间，同时减少了主动觉醒时间。
SSW和地西泮增加了NREM睡眠周期的平均长度，SSW能显著增加觉醒片段的数量以及 NREM 睡眠和觉醒之间的相互转化，而地西泮没有这种作用。
SSW对PCPA诱导的失眠模型的影响
如图3（A，B）所示，给予PCPA通过延长睡眠潜伏期和减少睡眠时间诱导小鼠失眠样行为。在PCPA模型中，所有SSW剂量均显著缩短睡眠潜伏期并延长睡眠时间。此外，4.4 g/kg SSW在延长睡眠时间方面的作用强于3 mg/kg地西泮。鉴于相同剂量的SSW在正常小鼠中与3mg/kg地西泮相比没有优势，作者推测SSW更有可能通过5-HT系统发挥作用。
图 3. SSW对失眠动物模型的影响
SSW对睡眠剥夺小鼠运动活动的影响
连续睡眠剥夺7天后立即收集24小时运动活动数据，与对照组相比，SD小鼠的运动能力显著下降（图3C），特别是在14:00-20:00光照期间。SSW使SD小鼠的活动恢复至正常水平，与模型组有显著差异。
SSW对换笼所致失眠大鼠睡眠的影响
作者分析了SSW对睡眠时间的影响，基于EEG（脑电图）和EMG（肌电图）记录的警惕状态分析表明，SSW和地西泮可以显著增加模型大鼠的总睡眠时间和NREM睡眠时间，并减少NREM睡眠开始时间和觉醒时间（图3D-G）。接受 SSW 治疗的大鼠 NREM 睡眠的平均发作持续时间有所增加（图3H-K）。
通过功能富集分析预测药物作用途径和靶标
接下来作者使用GO和KEGG功能富集分析探讨了SSW的作用机制。5-HT受体活性和5-HT突触通路在KEGG和GO分析中突出，表明5-HT是SSW睡眠调节作用中的关键神经递质。此外，该团队发现5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT2A和5-HT2C的靶标在血清素受体活性途径和血清素突触途径中富集。
图4. SSW的可能途径和靶点预测及实验验证。
SSW对睡眠障碍大鼠下丘脑血清素和5-HT1A/5-HT2A水平的影响
文献报道，5-HT1A和5-HT2A在睡眠调节中发挥相反的作用，因此该团队在后续的实验中对血清素和两个相关受体的作用进行验证。
如图 4F-G所示，模型大鼠（CA）的血清素水平降低，而 SSW（4.4 g/kg）治疗可逆转这种情况；地西泮治疗没有这样的效果。
进一步利用Western blotting实验探究SSW的关键靶点，添加SSW（4.4 g/kg）后模型组中5-HT1A表达显著降低，并且在治疗后维持在对照组水平，而5-HT2A的表达水平不受影响，这些结果表明 5-HT1A 可能是SSW的关键靶点。
文章结论
本文章通过网络药理学预测和体内验证，确定了SSW可能的活性化合物和作用途径，验证SSW的镇静催眠作用和睡眠调节潜力。首先，进行了数据库和文献的前期探索；其次，通过构建SSW复合物-目标-失眠网络，解读SSW与失眠之间的关系；第三，通过药效学实验评估SSW对睡眠调节的作用；最后，通过富集分析预测了可能的药效途径，并通过体内和计算机实验验证关键预测靶点。
图5.文章思路
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