克隆载体有哪些

分子克隆（molecular cloning）是指在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。用体外重组的方法将目的基因插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。

cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：

①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；

②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；

③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。

DNA片段的制备

常用以下方法获得DNA片段： ①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。

载体DNA的选择

①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。

M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主复制，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。

③柯斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。

DNA片段与载体连接

DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要步骤：

①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端；

②平末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；

③同聚寡核苷酸末端连接；

④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。

连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比例。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比例适当增加。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶3。

引入寄主细胞

常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞（通常为感受态细胞）混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用带抗性的培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

克隆的选择

①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。②间接筛选：载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。

丁阮彦1724基因工程中常用做克隆载体的dna分子有哪些 -
徒饰送13960095360 ______ 看你是高中水平还是大学水平了.高中水平:质粒,某些病毒的DNA 大学水平:细菌质粒,噬菌体载体,人工染色体载体等等

丁阮彦1724生活中的dna科学常用的基因载体有哪些 -
徒饰送13960095360 ______ 看你是高中水平还是大学水平了.高中水平:质粒,某些病毒的DNA大学水平:细菌质粒,噬菌体载体,人工染色体载体等等 根据来源:质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、非病毒载体、微环DNA 根据用途:克隆载体、表达载体 根据性质:温度敏感型载体,融合型表达载体、非融合型表达载体.

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徒饰送13960095360 ______ 质粒载体、噬菌体载体 理想质粒载体条件:1. 具有复制起始点2. 具有两种以上易被检测的选择性标记3. 在选择标记上具有多种限制酶的单一切点4. 具有尽可能小的相对分子质量5. 应属于松弛复制型6. 应为非传递性质粒 理想值粒载体例子:(一...

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丁阮彦1724为什么构建基因文库 -
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徒饰送13960095360 ______[答案] 在基因工程中,携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体,载体实际上是具有运载能力的DNA.依据功能,载体可以分为克隆载体和表达载体.克隆载体用于在宿主细胞中克隆和扩增外援片段;表达载体则用于在宿主细胞中获得外援...

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徒饰送13960095360 ______[答案] 在细菌或酵母等中的复制起始点 多克隆位点(切割用) 抗性或其他特殊基因(筛选用) 克隆的目的基因 可能主要是这些,凭记忆写的.