凝胶电泳注意哪些事项

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

详细 

实验方法

· 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 

实验材料

· DNA样品

试剂、试剂盒

· 尿素

· 去离子甲酰胺

· 丙烯酰胺

· 甲叉双丙烯酰胺

· 琼脂糖 

仪器、耗材

· PCR扩增仪

· 变性梯度凝胶电泳仪

· 凝胶成像及分析系统

· 紫外透射仪

· 高速离心机

· 电泳仪

· 电泳槽

· 微量加样器

· Tip头

· Tip头盒

· Eppendorf管

· Eppendorf管架

一、实验原理

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。

作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

二、实验用品

1．PCR扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；电泳仪；电泳槽。

2．尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖

3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。Tip头盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。

4．PCR扩增相关试剂

三、实验步骤

1．PCR反应（同前）

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。

3．垂直变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0～100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。

PCR产物加上样缓冲液后上样，300～400μl/孔，电压150V，温度60℃，时间2～4小时。

4．平行变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。

PCR产物加上样缓冲液后，25μl～30μl/孔，电压150V，温度60℃，时间3～6小时。

5．染色5分钟，凝胶成像仪分析结果。

四、注意事项

1、该实验中提取DNA，以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己。

2、严格按操作步骤。

荆苑潘3814琼脂糖凝胶电泳操作应注意哪些环节 -
宓庙聪18261981963 ______ 1. 根据片段大小配制不同浓度的胶(改变分辨率),片段越小,需要胶浓度越大. 2. 胶要现制先用. 3. 选择合适的Marker. 4. 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种,且浓度一致(1倍). 5. 点样时要加入loading buffer,并注意,不要将样点到点样孔之外(飘样),也不要将胶戳漏(漏样). 6. 根据片段大小,及电泳检测目的,选择合适的电压及电泳时间. 7. EB染色.可选择制胶时加入EB(要在溶玩胶后,且温度至室温时(用手握住制胶容器,不烫手即可));或电泳结束后,将胶放入EB溶液中染色.

荆苑潘3814电泳时要注意些什么? -
宓庙聪18261981963 ______ 主要注意一下几点: 凝胶正负极不要弄反向了, 控制电压及电泳时间,严控条带跑出 点样时,点样量不要溢出点样孔,注意枪头捅破点样孔的凝胶. 电泳时需要marker做对照,用于验证目拟标片段的大小, 电泳缓冲液需定期更换 相信做到以上几点,应该问题不大

荆苑潘3814琼脂糖凝胶电泳使用什么染色?需要注意什么问题? -
宓庙聪18261981963 ______ 琼脂糖凝胶电泳的染料有许多种,近几年较常用的有: EB-溴乙锭,EB有较大毒性,可致癌,所以使用时一定要万分小心.EB染色的背景较强. SYBR Green--也叫荧光绿如蓝,低毒性,但检测灵敏度没有EB高. GelRed--号称无毒,无皮肤渗入型,有伤口就不好说了.背景荧光弱,但加多了容易出现拖带.由于在市场上价格较高,所以有出现很多仿冒货,买时要擦亮眼睛.

荆苑潘3814非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native - PAGE)应该注意哪些问题 -
宓庙聪18261981963 ______ 1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中,蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关,还和蛋白质的分子量以及分子形状有关,其中蛋白质的等电点是最重要 的影响因子,要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统;2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中,要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性,所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度;3. 蛋白质的分子量较大,则电泳时间可以适当延长,以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开,反之亦然;4. 变性样品的离子强度不能太高(I

荆苑潘3814请问电泳仪的使用注意事项有哪些? -
宓庙聪18261981963 ______ 电泳仪/电泳槽注意事项:1. 电泳仪/电泳槽通电进入工作状态后,禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分,也不能到电泳槽内取放东西,如需要应先断电,以免触电.同时要求仪器必须有良好接地端,以防漏电.2. 仪器通电后,不要临...

荆苑潘3814在做凝胶电泳,什么可以替代溴化乙锭? -
宓庙聪18261981963 ______ Gold View或者Green View都可以替代溴化乙锭.实验室用了好长时间了,灵敏度会差一些,如果需要高分辨率的电泳还是推荐使用溴化乙锭,其他常规电泳替代品完全可以满足需要.

荆苑潘3814采用凝胶圆盘电泳法测定过氧化物酶同工酶的原理如何?有什么特色?操作中注意事项有 -
宓庙聪18261981963 ______ 1、所用器材必须清洁.特别是制备凝胶柱所用的玻璃管每次用后必须用洗液浸泡,再常规清洗,否则凝胶剥离困难. 2、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂,对皮肤有刺激作用,应避免直接接触. 3、电泳完毕后,上下槽电极缓冲液不可混合,因离子强度和pH值都已发生改变. 4.从玻璃管中将凝胶分离出来时,避免长针头戳烂凝胶.

荆苑潘3814核酸电泳的注意事项 -
宓庙聪18261981963 ______ 1. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用. 2. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块.倒入板中的凝...

荆苑潘3814请问电泳仪的使用注意事项有哪些? -
宓庙聪18261981963 ______[答案] 电泳仪/电泳槽注意事项:1.电泳仪/电泳槽通电进入工作状态后,禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分,也不能到电泳槽内取放东西,如需要应先断电,以免触电.同时要求仪器必须有良好接地端,以防漏电.2.仪器通电后,...

荆苑潘3814琼脂凝胶电泳原理及其注意事项? -
宓庙聪18261981963 ______ 凝胶电泳的原理是根据其分子量的大小来分离的