双酶切只有一条带的原因

冯左宁1655载体是否双酶切完全 -
孙壮馨15719966007 ______ 原载体质粒回收后电泳可能出现三条带 环状质粒、复制中间体、开环的质粒.复制中间体的大小接近质粒的两倍,开环的质粒跑的比环状的要快,在质粒的上方.不知你说的是哪两条; 双酶切看你的酶切位点设在哪里,理论上应该切下两个片段,如果两个片段大小上差距不大则电泳时很难分开,就是一条带了,如果切下的小片段很小,在电泳图上也很难显示;一般质粒双酶切不会出现这两种情况,所以我认为如果切开了应该是两条比较亮的带,上面的那条应该比下面的那条稍亮. 总之,应该设置没有切开的质粒做对照,做个比较就知道了; 希望对你有用

冯左宁1655双酶切好还是分步酶切好 -
孙壮馨15719966007 ______ 以环状质粒为例,一般可以采用第一个酶酶切后割胶回收进行第二个酶的单酶切、直接双酶切两种 单酶切:一个一个切,第一次环变直线,第二次,直线变两段 双酶切:直接会有两段 还有一种,完全弥散,没条带,即酶量过了.双酶切反应 ...

冯左宁1655质粒pcr结果很好,为什么酶切却做不出来 -
孙壮馨15719966007 ______ 质粒pcr结果很好,为什么酶切却做不出来 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了. 你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题. pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常. 换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.

冯左宁1655DNA酶切后电泳,条带呈复带的原因做双酶切,跑出来每个带都像一个“=”,都分别由两个极近的带组成.求可能的原因 -
孙壮馨15719966007 ______[答案] 你酶切的DNA是什么? 质粒的话,双酶切中间有几十bp以上,切出来的条带就是两条,这个你应该能判断的. 如果是pcr产物酶切出现了两条极近的带,那么很有可能是因为pcr产物纯化时有杂带污染,一开始跑胶的时候看不出来,后来你回收浓缩再...

冯左宁1655我扩增的菌液能扩增出来条带,但是做酶切切不出来目的条带?怎么回事?在线等待? -
孙壮馨15719966007 ______ 菌落PCR能扩增出目的条带,说明目的基因已经连入质粒. 而质粒酶切没有条带可能有两个原因: 1.酶切位点有问题,导致切不开,可以看测序结果. 2.酶有问题,或酶切体系有问题,建议重新酶切看有没有问题.

冯左宁1655双酶切后电泳为什么目的条带这么弱 -
孙壮馨15719966007 ______ 1,正好你的两个酶切位点将质粒分成大小相当的两个片段(可能性很小) 2,有一个位点没有切开(可能性极大) 3,两个位点都切开了,有一段dna太小,跑电泳跑出去了(自己看看两个片段该多大)

冯左宁1655双酶切连不上 -
孙壮馨15719966007 ______ 你连了几次,做了多久了? 我曾经为了构建一个双元载体,双酶切连接了半年..... 基因研究在保证所有操作都没有错、试剂也没有错的情况下,还得加上点运气 800的片段不算大,我最大的是1200片段和一个10K以上的质粒双酶切连, 你可以尝试根据目的片段和载体的电泳回收后浓度,设立不同的连接体系, 1:3-1:10都可以试试 然后延长连接的时间~~~~~ 转化的时候,你可以做个阳性对照,可以验证你的感受态好不好,以及你的转化操作没有问题~~~ 加油~~~

冯左宁1655目的片段连接表达载体后酶切出非特异带为什么 -
孙壮馨15719966007 ______ 如果酶切时间过长,可能会出现星号活性的影响,酶切位点的识别特异性会下降.

冯左宁1655怎样判断双酶切后是否成功获得目的片段 -
孙壮馨15719966007 ______ 这个问题好像比较混.酶切切开走胶看小片段啊,如果你看到了小片段那就认为有切开但不一定是完全.如果那是那种两个位点之间很小,那么只能看到片段,没有切开的是超螺旋跑在前面,且...

冯左宁1655DNA酶切后电泳,条带呈复带的原因
孙壮馨15719966007 ______ 你酶切的DNA是什么?质粒的话,双酶切中间有几十bp以上,切出来的条带就是两条,这个你应该能判断的.如果是pcr产物酶切出现了两条极近的带,那么很有可能是因为pcr产物纯化时有杂带污染,一开始跑胶的时候看不出来,后来你回收浓缩再加上酶切,再跑电泳的时候就出现了两条极近的带.其实将这两条带回收(上面那条是目的条带的可能性要大些),进行连接,只要操作和实验条件好的话,菌落的阳性率也挺高的,因为是双酶切连接.