双酶切后载体为什么变小了

黎歪连3446我的目的片段连T载体后,挑单克隆摇菌,用菌液PCR能P出目的片段,再提质粒用Ecor1做酶切,片段变小怎么回 -
居缸重18911299639 ______[答案] 片段变小? 你的目的片段里有没有这个酶切位点?你的目的片段有多大? 建议用双酶切,将片段切出后电泳,如果有该片段,在电泳时就一目了然了.

黎歪连3446pcr扩增出的片断正确但双酶切结果却偏大,不只是为什么??请高手指点??? -
居缸重18911299639 ______ 可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.

黎歪连3446pET28a双酶切后连接目的基因,什么也不长 -
居缸重18911299639 ______ pET28a双酶切后连接目的基因什么也不长可以考虑对DNA进行定量.一般来说,设计一个连接反应,载体量最少需要50~100ng,而外源片段的分子数是载体分子数的3~10倍(具体质量取决于你的载体或外源片段的大小).连接体系为10ul,转化时用一半(5ul)转化50ul感受态细胞(最好用购买的感受态细胞,感受态的效率有保证),留下另一半备用.最好设置各种对照,以方便分析失败的原因,包括空载体连接对照等.

黎歪连3446请问质粒双酶切时得到的目的条带较大是什么原因? -
居缸重18911299639 ______ 内切酶可能与DNA片段结合,造成条带凝胶迁移率改变.你可以在电泳前65℃加热10min,或者采用加有SDS的loading dye加样.这样可以消除迁移率变小的问题.

黎歪连3446PCR产物和质粒双酶切后电泳如何判断酶切完成? -
居缸重18911299639 ______ 你是不是要把双酶切后的质粒与载体连接,而无论是PCR还是载体都无法通过电泳判断是否酶切完全,所以不好进行连接呀?对于PCR产物一般会采取这样的策略,将产物首先连接到T载体上,然后再用设计好的双酶切,电泳回收切下的条带,这样就能确保得到的是完全酶切的产物.载体判断比较麻烦,要看载体本身、多大双酶切为点之间的条带有多大、双切前后的大小是否能通过电泳区别出来,但是双切位点一般都在标记基因里面,所以插入片段的载体会在后期转化可以后区分开,所以也没有太大必要确定他是否完全,只要充分酶切就好了.

黎歪连3446重组质粒双酶切带与PCR扩增带大小不一 -
居缸重18911299639 ______ 大小不一是差多少?你PCR扩增出来的时候是多长?双酶切出来是多长? 你最好先把重组质粒单酶切看一下,有可能是你的质粒不纯,混了别的质粒;另外,用软件再检查一下你的质粒序列,不要别的位置上有双酶切可以切开的位点;还有,你酶切时间多长?可以过夜切一下试试看 你转化质粒到菌里去之后,有没有用PCR的方法去做菌落或者质粒的鉴定?你1KB的带,酶切鉴定出来2KB,说明质粒肯定不对的嘛,或者还有一个可能你把MARK长度记错了

黎歪连3446双酶切质粒后电泳 的问题 -
居缸重18911299639 ______ 很显然是质粒发生了自连啦.切开的2个质粒连起来了,因此相当于2个质粒的大小.你需采用磷酸化避免自连发生.

黎歪连3446pcr扩增出的片断正确但双酶切结果却偏大,不只是为什么?请高手指点?我的酶切底物是构建好的质粒载体.原来还酶切的正确但自从转菌之后再提取质粒... -
居缸重18911299639 ______[答案] 可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.

黎歪连3446双酶切防止目的基因反接 -
居缸重18911299639 ______ 双酶切以后目的基因上是有标记基因的,所以看是否有标记基因就能判断是否导入了多余基因.单切酶的话同理,如果是一个切割位点就更没问题了.

黎歪连3446载体双酶切后消失,怎样解决
居缸重18911299639 ______ fermentas 目录上有,bamh1 ph大于8.0时有很强的星号活性,bufferR ,ph 8.5,可以换buffer G试下