同源重组法构建载体原理

贡进娴2600如何通过构建突变载体的方法使细胞内基因低表达 -
沙璐匡17094316665 ______ 构建突变载体的方法主要是采用高GC多位点定点PCR扩增发,引起扩增时载体序列重叠,从而获得和构建突变载体.当然,突变载体要和目标低表达基因有同源性或相近性,在复制和表达时,可以实现替代.然后将突变载体导入宿主细胞中进行突变载体与宿主细胞基因之间进行同源重组,或进行变性复制等,可以将目的基因进行定点敲除,进而实现细胞内基因的低表达.

贡进娴2600载体和目的基因分别经限制性酶切后,产生不同的3'突出粘性末端.设计实验方案,构建重组质粒. -
沙璐匡17094316665 ______ 方法非常多,列举一两个: 1. 不同的粘性末端不能相连.所以,如果要相连,就要去除不同的粘性末端,进行平末端相连. 粘末端变成平末端有两种方法:klenow酶的补平或者s1核酸酶的切平. 为了减少载体自连,可以用碱性磷酸酶处理载体. 最后将载体和目的基因链接,构建重组质粒. 2. 设计引物,自带酶切位点,扩增目的基因,直接改变目的基因的酶切位点,然后再用和载体相同的限制酶酶切目的基因,切出相同的粘性末端. 直接将酶切完成的目的基因和载体连接.

贡进娴2600什么是构建载体? -
沙璐匡17094316665 ______ 基因表达载体的构建(即目的基因与运载体结合)是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心. 将目的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程.如果以质粒作为运载体, 首先要用一定的限制酶切割质粒,使...

贡进娴2600cDNA能构建基因敲除载体吗 -
沙璐匡17094316665 ______ 1、利用基因同源重组进行基因敲除.基因载体的构建,把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因等)的载体上,成为重组载体. 2、利用随机插入突变进行基因敲除.利用某些能随机...

贡进娴2600基因治疗的基因转移是什么?
沙璐匡17094316665 ______ 1.基因转移方法(1)特异正常基因的分离与克隆:应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果,已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆,这是基因治...

贡进娴2600同源重组都要蛋白的参与吗,比如Rec蛋白等?转基因小鼠时,外源DNA注入ES细胞进行同源重组需要蛋白参与吗 -
沙璐匡17094316665 ______ 同源重组的一个关键步骤是重组酶的催化作用下发生的链交换.所以同源重组需要一系列的蛋白质的参与,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等.转基因小鼠进行同源重组的原理是相同的,同样需要重组酶的催化作用.

贡进娴2600位点特异性重组的同源重组 -
沙璐匡17094316665 ______ 我们可以看到,同源重组一般都在染色体内仍按DNA序列的原来排列次序.但是在所谓位点特异性重组(site-specific recombination)中,DNA节段的相对位置发生了移动,从而得到不同的结果─DNA序列发生重排.位点特异性重组不依赖于...

贡进娴2600如何构建一个基因的过表达载体 -
沙璐匡17094316665 ______ 当拿到一个基因的DNA片段后,就需要把它导入一个载体,一方面长期保存.另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中.基因表达载体的构建是基因工程的核心. 常用的载体有细菌质粒,噬菌体和动植物病毒.其中质粒载体最常用...

贡进娴2600有用同源重组法进行基因克隆和载体构建的吗 -
沙璐匡17094316665 ______ 有,现在在分子克隆领域应用十分广泛.其优点是可以避开酶切,节省时间.缺点是有时候重组效率比较差.