实验室刻度吸管的使用

​内毒素-菌体中毒性物质总称

名词解释：
      ◆ 热原（Pyrogen）：凡是能造成生物机体体温上升的物质均可称为热原。
      ◆ 内毒素（Endotoxi）：由革兰氏阴性菌外层细胞膜在死亡或分裂时产生的物质。主要成分为脂多糖（LSP, LipoPolySaccharide），其单位为Eu/mg或Eu/U）。内毒素是一种热原，其它可造成体温升高的热原还有如：革兰氏阴性菌的肽葡萄糖（Peptidoglycan），脂磷壁酸质（lipoteichoic），物胞壁酰肽（muramyl  peptides），寄生虫等。

各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。可刺激机体产生抗体，但无中和作用，形成抗毒素，经甲醛处理不能成为类毒素。

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。虽然内毒素紧密地嵌入细胞壁中，但也会不断地向周围环境释放内毒素，这种释放不仅仅是因为细胞的解体和死亡造成的，也会发生在正常细胞生长和分裂过程中。

内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。与外毒素不同之处在于：内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素；把内毒素注射到机体内虽可产生一定量的特异免疫产物（称为抗体），但这种抗体抵消内毒素毒性的作用微弱。

内毒素检测方法选择的考量

内毒素的检测方法有哪些？

1，凝胶法简便易操作，有可能无法排除干扰作用；若样品稀释到MVD仍不能排除干扰作用，应进一步对供试品的前处理进行研究，再用干扰试验验证是否能用凝胶法。

2，光度法包括浊度法和显色法，可定量检测内毒素的含量。能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对风险，定量检测的数据不仅有利于追踪产品质量趋势，还能起到风险预警的作用，更易达到数据完整性的要求。

3，凝胶法常用的反应容器为玻璃小试管或安瓿瓶；光度法常用的反应容器为测定仪器专用的试管或酶标板。

内毒素检测注意事项

1，实验前应复核鲎试剂产品的灵敏度和自身凝集时间，因为鲎试剂本身灵敏度的改变或质量不符合要求，能影响实验结果。

2，细菌内毒素工作品效价误差或不稳定，可影响实验结果。

3，严格使用厂家配备的细菌内毒素检测用水。

4，实验操作误差：操作顺序和熟练程度尤为重要。一般顺序：制备内毒素标准溶液、稀释样本、溶解鲎试剂、摆放试管、加样或加试剂、封口恒温、观察结果并记录。

5，实验器具的洁净度影响：硫酸浸泡4h，蒸馏水冲洗，干热灭菌。

6，实验条件：洁净、无尘埃空气流通。

7，温度：室温25±2℃，恒温水浴温度为37±1℃。

8，样本自身干扰，对含有多糖类药品或培养基上清，应选用特异性鲎试剂或普通鲎试剂+G因子抑制剂。pH不在检测范围内的及时调整。

内毒素检测的影响因素

试验条件与操作：培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异。

◆ 时间：鲎试剂在液态时不稳定，室温放置太久会影响反应灵敏度，加样结束后，应立即放入恒温水浴中，延长保温时间，可提高LAL的灵敏度。5分钟混合点的活性最强，混合时间越长，活性反而降低，但在三十分钟以内的各混合时间点测定的灵敏度均在规定范围内。在显色法中灵敏度与时间有关，实验中既要严格控制每个环节的保温时间，又要严格控制终止时间。

◆ 温度：凝胶试验规定的孵化温度为37℃，实验证明，保温在25-41℃，随着温度的升高，LAL的灵敏度也随着升高，在41-46℃之间，对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂。

◆ pH值：鲎试剂的pH作用区间是6-8之间，7.0-7.5最佳。

◆ 试验耗材：内毒素稀释不宜用注射器，应使用经过校正的刻度吸管。且针栓胶塞容易吸附内毒素而使其浓度不够，造成凝胶反应不成立。

◆ 操作程序：加样次序可能会出现实验结果不成立等问题。

◆ 处理作用：不同产品处理和储存条件可能为出现分析的误差，鲎试剂溶解后的保存条件等。

供试品

      ● 多糖：β-葡聚糖可以激活G因子使得结果呈阳性。实验室常用的酒精、棉球等含有较多的葡聚糖，低于一定浓度的葡聚糖或LAL-RM（反应物）不足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性，但如果有细菌内毒素共同作用的情况下，凝集反应会变得更为激烈和迅速，很容易使反应出现阳性结果。

      ● 蛋白：
      〖阳离子蛋白〗：溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，从而影响用鲎法来测定内毒素。在测定之前使用蛋白酶K来消化样品，可使细菌内毒素的回收率达到百分之百。
      〖血红蛋白〗：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活G因子。研究表明使用一般鲎试剂测定人血白蛋白、球蛋白等血液制品的阳性检出率明显高于用去G因子LAL测定的阳性率，而后者与兔热原检查结果基本一致。
      〖免疫蛋白〗：免疫球蛋白可以激活G因子途径。

      ● 离子：离子强度较大会引起内毒素的聚集，加重低浓度内毒素不易分散的问题；另外LAL中的C因子必须在二价阳离子的参与下才能被激活形成活化的C因子。研究发现镁离子增强了LAL显色反应，钙离子浓度大于5mmol/L时抑制反应。当溶液中含有EDTA等络合剂或抗凝剂时，阳性离子会失去作用，也就会影响测定。

      ● 有机盐：核酸钠能像内毒素一样被检出，出现假阳性干扰。

      ● 透析液：鲎试剂测定透析液中的内毒素方法待进一步考察。

      ● 中药成分：清热解毒类药物等能够干扰LAL试验。

      ● 生化药品：氨基酸对鲎试剂有较强的抑制作用。

      ● 其它物质：多种凝血因子、蛋白质变性物质、高糖溶液、络合物、电解质、维生素、添加剂等都会干扰鲎试剂形成凝胶。

      ● 鲎试剂内源性因子：试剂盒内部因子干扰。

      ● 试剂质量：批次、溶解水、灵敏度等。

综上所述，内毒素检测方法种类多样，且影响因素较多，实验干扰较多，包括实验的操作步骤，对样品的处理等等方面，因此会导致自检数据与厂家有所差异。

文章来源：“逍鹏生物”GZH，作者~VivaCell&BI市场。
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