常用蛋白酶抑制剂

2019年1月，青海大学附属医院肿瘤放疗科陈凡教授团队于《中华肿瘤防治杂志》发表文章：弹性蛋白酶抑制剂对小鼠Lewis肺癌放射性肺损伤保护作用研究。该文章构建了小鼠Lewis肺癌模型，进而探究放疗对小鼠Lewis肺癌的治疗效果及相应肺损伤情况，并进一步评价中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司他钠在放疗后小鼠Lewis肺癌模型中的作用。结果显示，20 Gy放射剂量对小鼠Lewis肺癌有明显治疗作用，但同时导致小鼠放射性肺损伤，而西维来司他钠治疗对小鼠放射性肺损伤具有缓解作用。基于此，作者得出结论，中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司他钠能够减轻放射性肺损伤，并且不影响放疗对小鼠Lewis肺癌的治疗效果。

目的：本研究旨在探讨中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司他钠对小鼠Lewis肺癌放疗导致放射性肺损伤的保护作用，并评价西维来司他钠对肿瘤放疗效果的影响。

方法：将Lewis肺癌模型小鼠随机分为四组：对照组，单纯放射治疗组，放疗+ 50 mg/kg西维来司他钠组以及放疗+100 mg/kg西维来司他钠组，每组10只鼠。X射线20 Gy照射肿瘤和小鼠全胸1次，腹腔注射西维来司他钠1次/d，连续27天。

结果：放疗+50 mg/kg西维来司他钠和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组肺泡灌洗液以及血清中的弹性蛋白酶相对活性低于单纯放射治疗组，差异有统计学意义。病理结果显示，与单纯放射治疗组相比，放疗+50 mg/kg西维来司他钠组和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组小鼠肺损伤减轻。放疗+50 mg/kg西维来司他钠组和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组肺组织的中性粒细胞低于单纯放射治疗组，差异有统计学意义。此外，放疗+50 mg/kg西维来司他钠组和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组的肿瘤质量与单纯放射治疗组相比差异无统计学意义。

结论：弹性蛋白酶抑制剂西维来司他钠能够减轻放射性肺损伤，并且不影响放疗对小鼠Lewis肺癌的治疗效果。

放射治疗是临床肿瘤治疗的重要方式，放射野内射线会影响人体正常细胞和组织，造成不同的器官损伤。放射性肺损伤（Radiation-Induced Lung Injury，RILI）早期表现为放射性肺炎，后期会进一步发展为放射性肺纤维化，严重影响肿瘤患者的生活质量，并减弱放疗效果。目前针对RILI的治疗并没有有效的方法，糖皮质激素能协助减轻RILI症状，但不能阻止RILI疾病进展。

中性粒细胞过度浸润和激活是肺损伤的重要因素，浸润至肺组织的中性粒细胞能够释放活性氧和弹性蛋白酶等破坏肺泡和毛细血管屏障，损伤上皮和内皮细胞。中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase）是一种储存于中性粒细胞中的丝氨酸蛋白酶。在多种炎症性疾病过程中，NE从中性粒细胞中释放，进入炎症区域促进炎症进程。西维来司他钠是NE特异性抑制剂，能够抑制中性粒细胞激活，缓解肺损伤。本研究构建了小鼠Lewis肺癌模型，通过对小鼠肺癌进行放射治疗，并应用西维来司他钠作为防治RILI药物，进一步研究西维来司他钠对放射性肺损伤的干预作用。此外，本研究也将评价NE抑制剂对肿瘤放疗效果的影响，以期为后续临床研究提供实验依据。

1. Lewis肺癌小鼠模型构建

小鼠适应性饲养7天后，在小鼠右侧腋窝皮下接种Lewis肺癌细胞，每只接种1×106。待肿瘤直径约0.6 cm时，采用随机数表法将小鼠分为对照组、单纯放射治疗组、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组，10只/组。实验结束时，处死小鼠，立即解剖，称量小鼠肿瘤质量。

2. Lewis肺癌小鼠放射治疗和给药

采用小动物辐照仪经前胸野单次照射肿瘤和小鼠双侧肺脏20 Gy，照射参数为225keVX射线，源皮距50cm，照射野20 cm × 2 cm（2 cm为小鼠颈部至胸段距离，其他部位用制作好的铅板模型遮挡）。放疗后开始腹腔注射西维来司他钠（50、100 mg/kg），1次/d，连续给药27天。实验期间小鼠自由摄食及饮水。

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放疗对荷瘤小鼠肺泡灌洗液和血清中NE活性影响

肺泡灌洗液NE活性检测结果显示，对照组（1）、单纯放射治疗组（2）、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组（3）和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组（4）中NE相对活性分别为1.03 ± 0.19、2.97 ± 0.39、1.91 ± 0.21和1.39 ± 0.18。组间均值差异有统计学意义，F=31.844，P＜0.001；两两多重比较分析显示，P1－2＜0.001，P2－3=0.001，P2－4＜0.001。外周血NE检测结果显示，对照组（1）、单纯放射治疗组（2）、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组（3）和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组（4）中NE相对活性分别为1.00 ± 0.24、2.65 ± 0.36、1.93 ± 0.15和1.31 ± 0.19。组间均值差异有统计学意义，F=25.580，P＜0.001；多重比较分析显示，P1－2＜0.001，P2－3 =0.008，P2－4＜0.001。结果提示放疗会引起Lewis肺癌荷瘤小鼠肺泡灌洗液和血清NE活性增高，而西维来司他钠能够降低肺泡灌洗液和血清NE活性。

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西维来司他钠对荷瘤小鼠放射性肺损伤保护作用

肺组织病理HE染色结果如图1所示。与对照组相比，单纯放射治疗组肺泡结构被破坏，肺泡间隔不规则增厚，肺泡间隔毛细血管充血，放疗+50 mg/kg西维来司他钠组和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组肺泡结构损伤减轻，肺泡间隔恢复，肺泡间隔毛细血管充血减轻。结果提示，西维来司他钠能够明显减轻Lewis肺癌荷瘤小鼠放射性肺损伤。

图1 西维来司他钠对Lewis肺癌荷瘤小鼠放射性肺损伤的影响（HE染色）

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西维来司他钠对肺泡炎症渗出影响

对照组（1）、单纯放射治疗组（2）、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组（3）和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组（4）中肺泡灌洗液中有核细胞数分别为（0.92 ± 0.20）×105、（3.70 ± 0.36）×105、（2.63 ± 0.32）×105 和（1.57 ± 0.25）×105 /mL。组间均值差异有统计学意义，F=53.210，P＜0.001；两两多重比较分析显示差异有统计学意义，P1－2＜0.001，P2－3=0.002，P2－4＜0.001。结果显示，相对于对照组，单纯放射治疗组肺泡灌洗液有核细胞增多，而放疗+西维来司他钠组肺泡灌洗液中有核细胞数明显降低。此外，对照组（1）、单纯放射治疗组（2）、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组（3）和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组（4）中肺泡灌洗液中总蛋白浓度分别为（0.27 ± 0.10）、（0.96 ± 0.20）、（0.61 ± 0.09）和（0.41 ± 0.05） mg/mL。组间均值差异有统计学意义，F=18.465，P=0.001；两两多重比较分析显示，P1－2＜0.001，P2－3 =0.008，P2－4=0.001。结果显示，相对于对照组，单纯放射治疗组肺泡灌洗液中总蛋白浓度升高，而放疗+西维来司他钠组肺泡灌洗液中总蛋白浓度降低。这一结果提示西维来司他钠能够减轻放疗引起的肺泡炎症性渗出。

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西维来司他钠对放疗小鼠肺组织中性粒细胞浸润影响

如图2所示，对照组（1）、单纯放射治疗组（2）、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组（3）和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组（4）中肺组织中性粒细胞的比例分别为（2.58 ± 0.72）%、（6.52 ± 1.01）%、（4.50 ± 0.51）%和（3.71 ± 0.69）%。组间均值差异有统计学意义，F=14.589，P=0.001；多重比较分析显示，P1－2＜0.001，P2－3=0.011，P2－4=0.002。结果显示，相对于对照组，单纯放射治疗组肺组织中性粒细胞浸润增多，而放疗+西维来司他钠组肺组织中性粒细胞浸润降低。

图2 西维来司他钠对Lewis肺癌荷瘤小鼠放射性肺损伤中肺组织中性粒细胞浸润影响

A. 肿瘤模型组；B. 肿瘤放疗组；C. 肿瘤放疗+西维来司他钠组（50 mg/kg）；D. 肿瘤放疗+西维来司他钠组（100 mg/kg）

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西维来司他钠对小鼠Lewis肺癌放疗效果影响

如图3所示，放疗27天后，对照组（1）、单纯放射治疗组（2）、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组（3）和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组（4）肿瘤质量分别为（7.9 ± 1.0）、（2.3 ± 0.6）、（2.2 ± 0.4）和（2.3 ± 0.3）g。组间均值差异有统计学意义，F=206.162，P＜0.001；两两多重比较P1－2＜0.001，P1－3＜0.001，P1－4＜0.001，P2－3=0.829，P2－4 =0.949。结果提示，在治疗放射性肺损伤的同时，西维来司他钠并不影响放疗对Lewis肺癌的治疗效果。

图3 放疗和西维来司他钠对荷瘤小鼠肿瘤生长影响（n = 10）

A. 肿瘤模型组；B. 肿瘤放疗组；C. 肿瘤放疗+西维来司他钠组（50 mg/kg）；D. 肿瘤放疗+西维来司他钠组（100 mg/kg）

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西维来司他钠对小鼠体质量影响

放疗27天后，对照组（1）、单纯放射治疗组（2）、放疗+50 mg/kg西维来司他钠组（3）和放疗+100 mg/kg西维来司他钠组（4）小鼠体质量分别为（31.86 ± 0.77）、（24.83 ± 1.49）、（24.58 ± 1.61）和（24.68 ± 1.40）g。组间均值差异有统计学意义，F=69.843，P＜0.001；两两多重比较，P1－2＜0.001，P1－3＜0.001，P1－4＜0.001小鼠体质量降低；P2－3 = 0.683，P2－4 = 0.809，小鼠体质量差异无统计学意义。

放射性肺损伤属于放疗相关的严重不良反应，因此研究其发病机制并设计合适的治疗方案具有重要临床意义。本研究构建了小鼠Lewis肺癌模型，并借此探究放疗治疗效果及肺损伤情况，结果显示20 Gy放射剂量对小鼠Lewis肺癌有明显治疗作用，但同时也导致了小鼠放射性肺损伤。研究表明，急性肺损伤过程中，中性粒细胞浸润并释放NE，破坏肺泡上皮和内皮细胞，进一步加重肺损伤。因此，本研究进一步检测小鼠Lewis肺癌模型的肺组织中性粒细胞浸润和NE活性情况，结果显示，放疗导致肺泡炎症性渗出，肺组织中性粒细胞浸润增多，血清和肺泡灌洗液中NE活性增强，提示中性粒细胞以及其释放的NE有可能参与放疗导致的肺损伤。西维来司他钠是一种人工合成的NE抑制剂，能够选择性抑制NE活性。本研究结果显示，在通过腹腔注射给予小鼠西维来司他钠后，小鼠肺泡炎症性渗出减轻，肺组织中性粒细胞浸润减少，肺泡灌洗液NE活性降低，肺损伤缓解。

综上所述，NE抑制剂西维来司他钠在缓解放射性肺损伤的同时，不影响放疗对小鼠Lewis肺癌的治疗效果。基于此，NE抑制剂为放射性肺损伤的防治提供了新的思路。

参考文献：

林晶,胡旭东,李向阳等.弹性蛋白酶抑制剂对小鼠Lewis肺癌放射性肺损伤保护作用研究[J].中华肿瘤防治杂志, 2019,26(02):88-93. DOI:10.16073/j.cnki.cjcpt.2019.02.004.

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