影响双酶切的因素

蔚风枝5063再次请教生物问题 -
梅婵空13685009081 ______ 一般,防止酶切产物自连最常用的就是双酶切,因为产生的粘性末端不同,所以很难发生自连.但实际上最后筛选的时候经常也会出现空载体的情况,这个很大一部分原因是有部分载体没有切动,并不是载体自连的问题.这些没有切动的载体转化率是非常高的,这是转化过程中假阳性的最大来源.载体自连最容易发生的情况有两种,一种是单酶切,一种是平末端连接.这两种情况下,通常为了防止载体自连会对酶切后的载体使用碱性磷酸酶处理,将DNA 5'端的-P基团置换成-OH,这样会一定程度的防止载体自连.

蔚风枝5063双酶切酶切体系和buffer怎么设计比较合适?
梅婵空13685009081 ______ 体系不管多大,都有相应的buffer,只要将buffer变为1X工作浓度就行了,两个同时切的话,需要注意酶的量,看单位是多少,一般是1ul的酶切1ug的质粒或者其它DNA序列,尽量酶的体积不能超过体系的10%,因为里面含有甘油,可能会影响酶切效率.

蔚风枝5063双酶切连接转化反应谁了解
梅婵空13685009081 ______ 1、回收PCR产物:在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用...

蔚风枝5063求助,双酶切切不开 -
梅婵空13685009081 ______ 不太明白你希望得到什么结果,单酶切的话环形质粒从酶切位点断开变成一条线性DNA,长度不变;双酶切的话就环形质粒就被切成一大一小两段线性DNA了,至于大小就要看质粒原本的大小和酶切位点的相对位置了

蔚风枝5063设计Ecor I和BamH I双酶切的目的是什么 -
梅婵空13685009081 ______ 是为了切出合适的粘性末端进行下一步的连接.将载体和目的基因用同样的酶进行酶切后,留出相同粘性末端进行连接

蔚风枝506319、影响SN2反应活性的主要因素包括底物的结构、亲核试剂的亲核...
梅婵空13685009081 ______ 单酶切就是只用一个限制性内切酶去切你的质粒,环状的质粒就成为线状的了,但质粒的大小不变双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒就变成两段线状DNA了.回收你需要的那一段,因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端(当然目的基因也要用这两种酶切才行),在T4DNA连接酶在作用下,它们就连到一起了.你该看看《生物化学》或基因工程方面的书.这都是基本的知识啊.

蔚风枝5063对于载体的单酶切和双酶切,胶图分别会如何?为什么会这样啊?谢谢帮忙回答? -
梅婵空13685009081 ______ 单酶切一个电泳道上会有几个比较亮的带,而且你所根据基因大小所选择的条带内也不一定是你要的.原因是单酶切形成的粘性末端完全相同,就像拼图,除了内容不同,两边完全切合.所以结合方式过多,可能性也多,如质粒和目的基因正确连接,质粒和目的基因反转连接,质粒和质粒连接,目的基因与目的基因的连接. 双酶切一般会有3条带,而且正确现象应只有一个是非常亮的.因为两种酶识别两个位点切开,无论是质粒还是目的片段两端的粘性末端完全不同,还是拼图,内容不同,两端切合口也不同,除了一种连接方式外没有其他连接了.胶途中3条带分别为:目的片段条带,空质粒条带,最亮的重组质粒条带.

蔚风枝5063为什么要对重组质粒DNA进行双酶切 -
梅婵空13685009081 ______ 双酶切就是为了验证是否有目的基因,如果双酶切条带正确,而且PCR也没有问题,就可以确定质粒构建成功. 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点.如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好.在质粒...