微量取样器

大肠杆菌转化可以：（1）将重组 DNA 分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达， 以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。

1 原理：

质粒 DNA 粘附在细菌细胞表面，经过 42°C 短时间的热击处理，促进吸收 DNA.然后在非 选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生 长。

2 器材：

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干 式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体 LB-Amp），超 净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

3 材料和试剂：

质粒 DNA，重组 DNA，培养基（不加抗菌素），LB 培养基（加抗菌素），无菌 ddH2O， IPTG，X-gal。

4 实验准备：

无菌 ddH2O，1.5ml  离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用 N,N-二甲基甲酰胺配）。

5 操作步骤：

（1）事先将恒温水浴的温度调到 42℃。

（2）从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰 上，冰浴 5~10min。

（3） 加入 5μl 连接好的质粒混合液（DNA 含量不超过 100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

（4）轻轻摇匀后插入 42℃水浴中 1~2min 进行热休克，然后迅速放回冰中，静置 3~5min。

（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入 500μl LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀， 然后固定到摇床的弹簧架上 37℃震荡 1h.

（6） 在超净工作台中取上述转化混合液 100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体 LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍 等片刻，待其冷却后再涂）。

（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加 40μl 2% X-gal， 8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

（8） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37℃恒温培养箱中 30-60min 直到表面的液 体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37℃恒温培养箱过夜。

（9）  在被细菌污染的桌面上喷洒 70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

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