提取dna的原理及步骤

[实验原理]

在 EDTA 和 SDS 等去污剂存在下，用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳 动构基因组 DNA，用此方法得到的 DNA 长度为 100-150 kb，适用于 L 嘴菌体构建基因组 文库和  Southern 分析。

通过本实验了解并掌握提取基因组 DNA 的原理和步骤，以及相对分子质量较大的 DNA的 琼脂糖凝胶电泳技术。

 [仪器、材料与试剂]

 (一)仪器

1.台式离心机

2.玻璃匀浆器

3．高压灭菌锅

4．恒温水浴

(二)材料

1．1.5mL 微量离心管

2．微量取样器和吸头

3．无菌过滤器(一次性)

4．10 mL 注射器

5．鼠肝

6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)

7.十二烷基硫酸钠(SDS)

8．乙二胺四乙酸(EDTA)

9．蛋白酶 K

10．RNA 酶

11．DNA 相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物

(三)试剂

1、1.5 mol／L\tNaCl

2、0.5 mol／L Tris·HCI\tpH8.0

3．0.5 mol／L EDTA\t\tpH8.0

4．3 mol／L NaAc\tpH5.2 以上均高压灭菌。

5．蛋白酶 K 10mg／mL 配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)

6．组织匀浆液 100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／ LEDTA(pH8.0)

7．酶解液  200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL 蛋白酶 K，1％SDS

8．无 DNA 酵的 RNA 酶 ： 将胰 RNA 酶溶解于 10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol／L NaCl 溶液中，浓度 l0mg／mL，于 100℃水浴处理 15min，以降解 DNA 酶，缓慢冷 却到室温，-20℃保存

9．TE 缓冲液 ：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)

10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)

11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)

12．5xTBE  5．4gTris，2．75g 硼酸  2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到 100mL；

13．6x 上样缓冲液  o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液

14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ  相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125

[实验步骤]

本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝 DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下 降。整个操作过程中，应尽量避免 DNA 酶的污染，特 g4 注童动作温和，减少对 DNA 的 机械捌伤。

1、取 0.2g 鼠肝，用冰冷的生理盐水洗 3 次，然后置于 2.0mL 匀浆掖中，用玻璃匀浆器匀 浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切匆将细胞破碎，可镜检观察)。

2、将组织细胞移至 1.5ml 离心管中，50000rpm 离心 30-60sec，(尽可能在低温下操作)， 弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入 1 倍于细胞体积的匀浆液洗一次。

3、沉淀加 0.8mL 无菌水迅速吹散，分两管，再加 0.4mL 酵解液，翻转混匀(动作一定要 轻)55℃水浴处理 12-18 h；

4、沉淀加 RNase 至终浓度 200µg／mL，37℃水浴 1 h；

5、加入等体积酚／氯仿／异戊醇抽提一次，(慢慢旋转混勾，倾斜使两相接触面增大)。4℃、 10min、10000rpm 离心；

6、有时如果 DNA 含量过高，水相在下层，实验时应注意观察。用扩口吸头移出含 DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)，加等体积氧仿／异戊醇，4℃、10 000rrpm 离心 10rain (若界面或水相中蛋白含量多，可重复 1．6 操作)。

7、用扩口吸头小心吸出上层含 DNA 的水相，加 1／10 体积的 NaAc，小心混匀(要充分)， 再向每管中加入 2.5 倍体积的无水乙醇，-20  过夜。

8、12 000rpm 离心 19min，弃上清，75％冷乙醇洗涤一次，12000rpm 离心 15min 室握温干燥(不要大干，否则 DNA 不易溶解)，加入适量 TE 缓冲液，存放于 4℃，轻摇溶解过夜，即可得  到实验动物基因组 DNA。

9、电泳鉴定 DNA，由于基因组 DNA 相对分子质量较大，用 0.3％的琼脂糖凝胶电泳鉴定， 先在底部锦一层 1％的支持胶，凝固后再铺上一层 0.3％琼脂糖凝胶，插上梳子(枚子不能瑾 到的支持胶)。取 1.5µL 溶解的 DNA、1µL 上样缓冲液和 35µl 无菌水混匀后小心上样(可在 另一孔加 DNA 相对分于质量标准)，观察基因组 DNA 大小，用溴化乙锭染色观察结果。

 [注意事项]

1、操作过程尽量在低温下进行，避免 DNA 降解。

2、琼脂糖凝胶脆弱，应小心操作。

3、提取得到的基因组 DNA 应为单一条带，DNA 降解可形成弥散带型。

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