正丁醇溶解

\n

Bt4\t2     78    4     0.079

Bt4\t4     76  4

转 Bt4    2     78    4   0.075

转 Bt4     4     76       4

标准曲线方程式：Y= aX+b.其中 Y 为 OD 值，X 为蛋白含量。a、b 通过作图输入数据可 知

相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得

OD 值测量过程：

比色皿用 70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加 入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定 OD 值。

3.双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）

3.1 水化液的制备

称取  2.0mg  的  DTT，用  700μl  水化液储液溶解后,加入  8μl  0.05% 的溴酚兰，3.5μl（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。 在含 300μg 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为 340μl，振荡器上振 荡混合,13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶

分两次吸取样品，每次   170μl,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡 30 分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后， 加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。

3.3 IPG 聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为 20℃） S1 (30v,12hr,360vhs,step)

S2 (500v,1hr,500vhs,step) S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)

S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)

S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共计 44110vhs,19.5 小时

其中 S1 用于泡胀水化胶条，S2 和 S3 用于去小离子，S4 和 S5 用于聚焦。

3.4 平衡 用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸， 如果为 18cm 的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略）， 然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡 的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液 A，平衡液 B 先 后平衡 15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。 平衡第二次时，在沸水中煮 Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽 度等同，然后吸取煮好的 Marker，转入 SDS—PAGE 胶面上，保持紧密贴合；同样在第二 次平衡时，煮 5%的琼脂糖 10ml。

4.双向电泳第二向---SDS-PAGE

4.1 配胶(两根胶条所用剂量)

分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加 APS 和 TEMED

30 %  丙烯酰胺储液 21.28ml

分离胶 buffer 20ml 10%APS 220μl TEMED 44μl

双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8% 10ml） 30 %  丙烯酰胺储液 1.6ml

浓缩胶 buffer 2.5ml 10%APS 30μl TEMED 5μl

双蒸水 5.9ml

4.2 灌胶 将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以 防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再 用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超 纯水,用保险膜封好。

4.3 转移

剪两个小的滤纸片，吸取 Marker 后，放入 SDS—PAGE 胶面的一端。然后，将平衡好的 IPG 胶条贴靠在玻璃板上,加少量的 5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的 时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将 IPG 胶条缓 缓加入 SDS—PAGE 胶面,其中不断补加 5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。

4.4 跑胶

浓缩胶  13mA  分离胶  20mA  共约 5.5 个小时

5.银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）

5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸 50ml，用超纯水定容至 500ml

5.2  敏化  30min  无水乙醇 150ml

Na2S2O3S226;5H2O 1.5688g

无水乙酸钠 34g

先用水溶解 Na2S2O3S226;5H2O 和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至 500ml

5.3 洗涤  5min × 3  次

5.4 银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至 500ml

5.5 洗涤  1min × 2  次

5.6 显影 无水 Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至  500ml

甲醛(37%)0.1ml,临时加

5.7 终止 10min EDTA—Na2S226;2H2O 7.3g 用超纯水定容至 500ml

5.8 洗涤 5min × 3 次 注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。

B． 实验相关试剂配制

1．  Bradford  工作液

95%乙醇  25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰 G250，溶解完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至 500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰 G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford 不稳定，一周内有效）

2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM（如果有条件可以添加 PMSF 0.5mM 和 5%的 Pharmalate）

3.水化液储液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4.分离胶 buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g

5.浓缩胶 buffer (pH6.8) 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6.凝胶储存液（30%的丙烯酰胺）250ml Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7.电极缓冲液（跑一次要配制 2500ml） 甘氨酸  43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g SDS 3g 2.5g

超纯水定容至 3000ml 超纯水定容至 2500ml 8．  0.5M Tris  —HCl pH 6.8 储液

6.1g Tris 先用 30ml 超纯水溶解，再用 46ml，3M HCl 调 pH6.8,再加水定容至 100ml

平衡液储液

脲（即尿素）36g

甘油  30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml  超纯水定容至 100ml

10.平衡液 A（一根胶条） DTT 20mg

平衡液储液 10ml 11．平衡液 B（一根胶条）

碘乙酰氨  300mg

平衡液储液 10ml

0.05%溴酚兰 15μl (平衡液 A、B 均需临时配制)

12．0.5%琼脂糖 10ml 琼脂糖 0.05g

电极缓冲液 10ml

溴酚兰 25μl

补：4、5、6 的溶液需过滤后储存于 4C 备用。

C． 药品

CHAPS  兼性离子去垢剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，

SDS 离子型去垢剂 提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出 尿素  离液剂 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质硫脲  离液剂 变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性

DTT 还原剂 断裂蛋白质分子中 Cys 残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分 提高 DTT 的浓度，由于它 pKa 在 8 左右，因而会影响 pH 梯度。DTT 在碱性 pH 下会去质 子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀

BSA Bradford 中制作标准曲线用

无水乙醇 和磷酸一起，提供 Bradford 中的环境

磷酸 提供 Bradford 中的酸性环境

Tris  构成缓冲液的成分，可用于抗衡 pH 的变化

IPG buffer

覆盖液 即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。

丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，

甲叉二丙烯酰胺 （Bis）在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维 网状结构

琼脂糖

溴酚兰 指示剂作用

碘乙酰氨（IAA）平衡液 B 中使用，中和 A 液中的 DTT 正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶 甘油 无机盐的良好溶剂，热稳定性好

Marker

考马斯亮兰 G250（Bradford 法用）考马斯亮兰 G250 有红、蓝两种不同颜色的形式在一 定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反 应迅速而稳定，反应化合物在 465~595nm 处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白 浓度的高低成正比关系，因此可检测 595nm 的光吸收值的大小计算蛋白的含量

甘氨酸  与 Tris 构成缓冲系统

AgNO3

EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程。

邵琛耍1759比较乙醇、正丁酉迷、正丁醇、正丁烷的溶解度,并说明理由. -
师伏呢18076658681 ______[答案] 乙醇和正丁醇都是醇类,根据相似相溶原理,在水中有一定的溶解度.乙醇,碳链短,所以比正丁醇更像水,所以其溶解度应该比正丁醇大.正丁酉迷和正丁烷相比,前者由于氧的存在,相对而言,更像水分子,所以溶解度前者高于后者.同...

邵琛耍1759正丁醇与叔丁醇的溶解度不同的原因这种说法我认为没有道理,因为三个甲基阻止水的进攻,应当更难溶于水才对. -
师伏呢18076658681 ______[答案] 首先明确溶解的条件,那就是丁醇与水的作用力与丁醇之间的作用力的比值越大,溶解越容易. 正丁醇和叔丁醇的区别在于前者的烷基长链可以彼此靠近,范德华力强,所以难溶解.而后者春分子之间作用力弱,相对地,与水作用力强.

邵琛耍1759哪一层是水哪一层是异丙醇 -
师伏呢18076658681 ______ 异丙醇和水是任意比例互溶的,所以不可能分层的 正丁醇的话,正丁醇可溶于水,饱和浓度大约7%,而水在正丁醇的溶解度大约20%.并非任意比例互溶,所以能分层,正丁醇比水轻,所以上层是水. 棕色瓶么,是为了避免太阳直射温度过高,因为正丁醇易燃易爆. 加水的原因是要配置水饱和正丁醇. 水饱和正丁醇是一种常用的溶剂,比如说溶解茚三酮,一些涂料,还有在做天然药化的时候,药材中化合物萃取提取等等.

邵琛耍1759为什么往正丁醇里面加水会有三层 -
师伏呢18076658681 ______ 同一温度时,水中溶解丁醇和丁醇中溶解水不相同,如摄氏20度水中溶解丁醇7.8%;丁醇中溶解水20%.水的相对密度大约是1;丁醇相对密度大约是0.81.你加的多少水,加水后出现三层的,上、中、下三层都是什么成分.看后你会明白的,如需要可继续讨论.

邵琛耍1759正丁醇沸点比乙醚沸点高,但是在水里的溶解度相同,为什么 -
师伏呢18076658681 ______ 要理解这个需要明白氢键是什么.正丁醇里有羟基,可以自己形成氢键,所以分子之间结合的更为紧密,想把分子拉开(液相变成气相的本质就是分子的距离增大能量增加)更加不容易,所以沸点高,乙醚里面没有羟基,只有一个氧,所以没办法自己形成氢键,沸点会低很多 在水里溶解的时候,水可以提供羟基,可以同时和正丁醇以及乙醚形成氢键,加上两个分子的分子量又一样,所以溶解性会差不多 如果还是不太理解,去查查书,看看氢键的介绍

邵琛耍1759两种液体互溶时,如正丁醇溶于水,怎么求正丁醇浓度? -
师伏呢18076658681 ______ 两种液体互溶时,如正丁醇溶于水,怎么求正丁醇浓度? 相溶,但不是太大,20摄氏度时正丁醇在水中的溶解度是7.7% ,水在正丁醇中的溶解度是20.1%.

邵琛耍1759正丁醚常用作有机反应的溶剂.实验室制备正丁醚的主要实验装置如图:反应物和产物的相关数据如下 相对分子质量 沸点/℃ 密度(g•cm - 3) 水中溶解性 正... -
师伏呢18076658681 ______[答案] (1)因为浓硫酸的密度大,应将浓硫酸加到正丁醇中,防止发生迸溅,所以正确的操作方法为:先加正丁醇,再加浓H2SO4或将浓H2SO4滴加到正丁醇中;正丁醇在浓硫酸、加热135℃条件下发生分子间脱水反应生成CH3CH2CH2CH2...

邵琛耍1759正丁醛是一种化工原料.实验室可利用如下装置合成正丁醛.发生的反应过程如下:反应物和产物的相关数据如下: 沸点/℃ 密度(g•cm - 3) 水中溶解性 正丁... -
师伏呢18076658681 ______[答案] (1)B仪器的名称是滴液漏斗,D仪器的名称直形冷凝管,故答案为:滴液漏斗;直形冷凝管;(2)加入沸石的作用是防止暴沸,故答案为:防止暴沸;(3)正丁醛密度为0.8017 g•cm-3,小于水的密度,故分层水层在下方,...

邵琛耍1759用什么方法能除去正丁醇中的色素 -
师伏呢18076658681 ______ 您没有说清是什么样的萃取液.如果是乙酸乙酯萃取液的话,那么您可能搞错了,因为正丁醇本身不怎么溶于水,本身是可以用作萃取溶剂的.如果是反应体系中有正丁醇,那么可以在反应完成之后,首先用减压蒸馏的办法(温度别太高)先去除大部分的正丁醇,最好是再加入少量的二氯乙烷蒸馏两次,再继续进行后处理.这样正丁醇的量会很少.如果已经萃取了,那没什么好办法,水洗或盐水洗基本上没什么效果.

邵琛耍1759在萃取中,水饱和的正丁醇溶液和正丁醇有什么不同? -
师伏呢18076658681 ______ 正丁醇俗称1-丁醇,英文简写为n-butanol;n-butyl alcohol;1-butanol,它是无色液体,有酒精味,相对密度0.8109,熔点-90.2℃,沸点117.7℃,与乙醇、乙醚及其它多种有机溶剂混溶.蒸汽与空气形成爆炸性混合物,爆炸极限1.45-11.25(体积). 水饱和的正丁醇溶液是溶解了很多的水的正丁醇溶液,由于物质之间极性的作用,能溶解大量的非极性物质,即增加了正丁醇的溶解度,适用于深度萃取…… 正丁醇溶液一般用于有机物质的提取,它本身微溶于水,溶于乙醇 、醚多数有机溶剂,用于制取酯类、塑料增塑剂、医药、喷漆,以及用作溶剂…… 一般可以互换使用,但是深度萃取或者制作炸药之类的物质时不能互换使用……