浓度十字交叉法

       文丨初八没烦恼
       编辑丨初八没烦恼


       化学防治是减轻农作物病害危害的有效方法
       ，在化学防治领域，人们关注的重点集中在杀菌剂的作用机制和病原菌的抗药性机制，而往往忽略病原菌在化学防治胁迫压力下的应答反应机制。
       在杀菌剂的胁迫压力下，植物病原菌可以通过多种途径减轻杀菌剂的危害，由禾谷镰孢菌侵染导致的小麦赤霉病是我国小麦生产上最具威胁的流行性病害之一。


       21世纪以来，受气候条件变化、秸秆还田等因素影响，我国小麦赤霉病的发生频率明显增加，该病害的流行不仅可造成小麦大幅度减产，还可导致脱氧雪腐镰孢菌烯醇等多种毒素污染谷物，严重威胁人类和动物的健康。
       目前，防治小麦赤霉病的药剂种类较少，
       提高现有杀菌剂的防治效果对有效防治小麦赤霉病至关重要。


       琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂是农业生产上非常重要的一类杀菌剂
       ，该类杀菌剂通过作用于电子传递链上的复合物II影响病原菌的呼吸链电子传递系统，阻碍其能量的代谢，从而抑制病原菌的生长。
       氟唑菌酰羟胺是中化集团开发的新一代的SDHIs杀菌剂，该药剂对小麦赤霉病具有优异的防治效果，2020年1月在我国小麦上登记使用。


       前期研究表明F.graminearum对该药剂存在中-高等抗性风险
       ，建议生产商将该药剂与其他杀菌剂轮换使用或复配使用。
       本研究采用转录组测序技术比较分析F.graminearum分别在SDHIs杀菌剂氟唑菌酰羟胺和苯并烯氟菌唑处理后的基因表达特征，从转录组水平揭示F.graminearum对SDHIs杀菌剂胁迫的应答机制，为开发SDHIs杀菌剂的协同增效药剂提供研究思路。


       转录组样品制备和文库构建
       将菌株PH-1接种到6%绿豆汤培养基，
       25℃、175r·min-1培养3d后，收集分生孢子
       ，取5mL1×105个·mL-1的分生孢子分别接种到100mLYEPD培养基，25℃、150r·min-1培养12h后，分别加入氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑。
       氟唑菌酰羟胺处理样品标记为PH-1-F、苯并烯氟菌唑处理样品标记为PH-1-B。由南京集思慧远生物科技有限公司进行转录组测序及初步数据分析。


       采用Trizol法提取样品菌丝总RNA，
       检测RNA的纯度、浓度、核酸吸收峰
       ，用带有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA，加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断。
       以mRNA为模板合成cDNA，利用AMPureXPbeads纯化cDNA，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPureXPbeads进行片段大小选择。


       最后通过PCR富集得到cDNA文库，
       使用Qubit2.0进行初步定量
       ，使用Agilent2100对文库的大小进行检测。
       库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行pooling，用Nova平台进行测序，测序读长为PE150。


       对RawData进行数据过滤，
       去除其中的接头序列及低质量reads
       ，获得高质量的CleanData，将CleanData与PH-1菌株的基因组进行序列比对，获得MappedData。
       基于MappedData，进行插入片段长度检验、随机性检验等测序文库质量评估，根据基因在不同样品的表达量进行差异表达基因分析、GO差异表达基因功能注释、KEGG功能富集等高级分析。


       FgFAH基因敲除突变体获得
       采用聚乙二醇介导的原生质体转化Split-markerPCR片段法对菌株PH-1的FgFAH基因进行敲除。
       以菌株PH-1基因组DNA为模板，
       分别对FgFAH基因上下游侧翼序列进行PCR扩增
       ，将FgFAH基因上下游片段分别一步克隆到PHYG1.4质粒中hyg基因上下游。


       以一步克隆获得的阳性质粒为模板，分别扩增包含前半部分hyg的上游目的片段和包含后半部分hyg的下游目的片段，用于原生质体转化。
       将菌株PH-1接种至6%绿豆汤培养基中摇培
       ，3d后将收集的孢子用YEPD培养基萌发11h左右，当菌丝萌发至孢子长度的2~3倍时过滤菌丝。


       将收集的菌丝加入酶解液中，酶解2h左右镜检并过滤原生质体，利用STCbuffer稀释原生质体至107个·mL-1。
       将原生质体悬浮液100μL，30%PEG40μL
       ，上下游目的片段各20μL混合并放置冰上孵育30min，加入1mL30%PEG，室温下再孵育5～10min。


       加入10mLRM培养基于以上混合物中倒两个平板，原生质体再生培养12~24h后用含有300μg·mL-1潮霉素B溶液的RM培养基覆盖上层，4~7d内长出转化子，将长出的转化子转移到含有潮霉素B的V8培养基上生长2~3d，转到新的PDA平板中。
       将FgFAH基因敲除突变体及亲本菌株PH-1分别接种于含不同浓度的氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑的YBA平板中，
       以不含杀菌剂的YBA平板做对照，25℃条件下培养4d
       ，观察敏感性差异并用十字交叉法测量菌落直径，计算EC50值。每处理重复三次。


       通过Illumina测序后，PH-1、PH-1-F和PH-1-B分别产生30026821、26277635和25070625个Reads，
       总的碱基数平均分别为9008046450、7883290650、7521187500，均大于6291456kb。
       为了揭示F.graminearum受到SDHIs杀菌剂胁迫后基因表达特征的变化，本研究通过转录组分析比较了SDHIs杀菌剂处理前后的差异表达基因，通过FPKM方法计算DEGs。


       相比PH-1，PH-1-F样品中有2520个基因差异表达显著，其中1374个基因上调表达，1146个基因下调表达，PH-1-B样品中有3959个基因差异表达显著，其中2090个基因上调表达，1869个基因下调表达。
       差异基因韦恩图分析表明：
       氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑分别处理后的DEGs中
       ，两者共有的上调DEGs有1180个，共有的下调DEGs有937个，分别占所有DEGs的51.7%和45.1%，表明氟唑菌酰羟胺和苯并烯氟菌唑对F.graminearum有相似的作用机制。


       GO功能富集分析显示：共同上调的差异基因中，参与线粒体翻译、有氧呼吸、ATP合成与运输、线粒体呼吸链复合物组成、氧化还原等过程的差异基因表达显著。
       表明F.graminearum可能通过增加线粒体电子传递链途径相关酶类基因以及跨膜运输途径相关酶类基因的表达来应对SDHIs类杀菌剂的胁迫，
       共同下调的差异基因主要参与生物膜形成、菌丝生长、转录翻译等过程。


       线粒体电子传递链相关基因
       SDHIs杀菌剂主要作用于病原菌线粒体电子传递链上的复合物II，即琥珀酸脱氢酶或琥珀酸-泛醌还原酶。该酶复合物由黄素蛋白、铁硫蛋白和另外2种嵌膜蛋白的4个亚基共同组成。
       此外，
       本实验室前期研究发现F.graminearum中存在FgsdhC的同源基因
       ，命名为FgsdhC2，本研究发现，PH-1-B、PH-1-F样品中基因FGRAMPH1_01T24629、FGRAMPH1_01T18325、FGRAMPH1_01T28127。


       表明F.graminearum通过上调琥珀酸脱氢酶亚基基因来维持复合物II的氧化还原作用
       ，提高琥珀酸脱氢酶的稳定性，应对SDHIs杀菌剂的胁迫。
       电子传递链位于线粒体内膜上，由5个复合物组成，SDHIs杀菌剂作用于复合物II，线粒体呼吸链的电子传递途径受到了干扰，与其相关的一系列反应都会发生变化。
       线粒体复合物III是一个多亚基复合物，每个复合物III核心包含一个细胞色素b、一个细胞色素c1和一个铁硫蛋白，这3个核心蛋白亚基负责电子的传递以及细胞色素C的还原。
       PH-1-B和PH-1-F样品中表达上调的基因中被注释为泛醇-细胞色素C还原酶活性的基因有6个，
       包括细胞色素b-c1的铁硫亚基基因及细胞色素b-c1的6、7、8、9和10亚基基因。


       复合物III的多个亚基基因上调表达，可能是F.graminearum通过增强电子的接收和向下传递的能力减轻复合物II受到抑制对线粒体呼吸作用的影响。
       延胡索酰乙酰乙酸水解酶在酪氨酸代谢途径中扮演重要角色
       ，其可将延胡索酰乙酰乙酸水解为延胡索酸和乙酰乙酸。


       故推测：SDHIs杀菌剂抑制了病原菌琥珀酸脱氢酶的活性，导致病原菌无法将线粒体基质中的琥珀酸氧化为延胡索酸，而FgFAH基因表达上调，可以生成更多的延胡索酸，缓解了SDHIs杀菌剂对F.graminearum正常生理代谢的胁迫伤害。
       ATP结合盒转运蛋白和主要协助转运蛋白在生物体内参与了很多重要的生理过程
       ，比如：转运次生代谢产物、参与胁迫反应等。


       本研究发现：F.graminearum在SDHIs杀菌剂处理后，2个ABC基因和4个MFS基因显著上调表达，其中FGRAMPH1_01T13949基因已经被报道与多重抗药性相关。
       推测F.graminearum通过上调表达ABC和MFS转运蛋白，
       增强对药剂的外排
       ，减少药剂在病原菌体内的积累量，从而降低杀菌剂对病原菌的毒性。


       染色质重塑复合物SWI/SNF在许多真核生物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。SNF2是SWI/SNF复合物的核心亚基，其HSA结构域能够显著抑制染色质重塑活性，在抗胁迫过程中起负调控作用。
       本研究发现与SNF2家族相关的5个基因下调表达
       ，这些基因在SDHIs杀菌剂处理后表达下调，表明F.graminearum通过增强染色质重塑活性来应对SDHIs杀菌剂的胁迫。


       菌株PH-1和FgFAH基因敲除突变体ΔFgFAH对氟唑菌酰羟胺的EC50值分别为0.008和0.002μg·mL-1，对苯并烯氟菌唑的EC50值分别为0.073和0.031μg·mL-1，FgFAH基因敲除后的F.graminearum对SDHIs杀菌剂的敏感性增强。
       这表明FgFAH参与了F.graminearum对SDHIs杀菌剂胁迫响应调控
       ，菌株PH-1和FgFAH基因敲除突变体ΔFgFAH在PDA培养4d时菌丝生长直径分别为6.10和6.95cm。


       本研究利用转录组测序技术分析了F.graminearum受到SDHIs杀菌剂胁迫后基因表达特征的变化。
       结果表明，
       F.graminearum可通过调节线粒体电子传递链复合物相关基因
       、泵转运蛋白以及染色质重塑复合物SWI/SNF的表达来缓解或减轻胁迫危害。


       发现F.graminearum在SDHIs杀菌剂处理后多个SWI/SNF复合物相关基因表达量下调，它们是否调控了多重抗药性相关基因的表达。
       从而降低了药剂对病原菌的毒性，
       还需要进一步的研究
       ，本研究中下调表达的SWI/SNF基因中，FGRAMPH1_01T19417基因敲除后菌丝生长和致病力受到严重抑制。


       还发现了其他一些有意义的基因表达量发生了改变，比如：FGRAMPH1_01T11901是一个交叉过敏原基因，该基因在SDHIs杀菌剂处理后显著下调表达。
       这表明SDHIs杀菌剂不仅能够抑制F.graminearum的菌丝生长还能够抑制其过敏原基因的表达，
       不同真菌的过敏原基因具有交叉反应
       ，这可为医学上防治真菌过敏的药物研究提供新的思路。

寇群帖3471如何用十字交叉法解浓度问题ppt课件 -
嵇顷泻15728771002 ______ 十字交叉法可用于溶液浓度的计算,例如溶液的稀释、浓缩或混合等计算题.使用此法,使解题过程简便、快速、正确.下面通过例题介绍十字交叉法的原理. 同一物质的甲、乙两溶液的百分比浓度分别为a%、b%(a%>b%),现用这两种溶液配制百...

寇群帖3471用十字交叉法解决 甲杯中有浓度为17%的溶液400克,乙杯中有浓度为23%的溶液600克.现在从甲、乙两杯中取出相同总量的溶液,把从甲杯中取出的倒入... -
嵇顷泻15728771002 ______[选项] A. 20% B. 20.6% C. 21.2% D. 21.4% 我用十字交叉法做出来居然是19.4%.

寇群帖3471十字交叉法怎么用?十字交叉法用在哪些地方?怎么用? -
嵇顷泻15728771002 ______[答案] 十字交叉法是进行二组分混合物平均量与组分计算的一种简便方法.凡可按M1n1+M2n2=M(n1+n2)计算的问题,均可按十字交叉法计算.式中,M表示混合物的某平均量,M1、M2则表示两组分对应的量.如M表示平均相对分子质量,M1、M2则表示两...

寇群帖3471这题十字交叉法怎么用,两瓶浓度不同得盐水混合液.60%的溶液是40克,40%的溶液是60克.要使得两个瓶子的溶液浓度相同,则需要相互交换()克的溶液? -
嵇顷泻15728771002 ______[答案] 浓度要相同,就是40克+60克的盐水浓度=(60%*40+40%*60)/(40+60)=48% 40克的盐水要减少的盐分=(60%—48%)*40=24—19.2=4.8克 需要交换x克溶液x*(60%—40%)=4.8 x=24 需要交换24克溶液

寇群帖3471化学上的十字交叉解法的解题步骤? -
嵇顷泻15728771002 ______ 化学十字交叉法的原理及应用 十字交叉法的介绍 十字交叉法可用于溶液浓度的计算,例如溶液的稀释、浓缩或混合等计算题.使用此法,使解题过程简便、快速、正确.下面通过例题介绍十字交叉法的原理. 同一物质的甲、乙两溶液的百分比...

寇群帖3471化学十字交叉法的分类及使用方法,求详解!重谢0.75mol/L的NAOH溶液200ml和0.5mol/L的H3PO4200ml混合,生成盐的物质的量浓度最接近于多少?请用... -
嵇顷泻15728771002 ______[答案] NaOH与H3PO4的反应,因为比例的不同,有三种产物 3NaOH + H3PO4 = Na3PO4 + 3H2O,NaOH/H3PO4=3 2NaOH + H3... x+y=0.5*0.2=0.1 解得,x=0.05mol,y=0.05mol 最后的溶液体积=200+200=400mL=0.4L 所以,NaH2PO4和Na2HPO4的浓度都...

寇群帖3471十字交叉法具体怎么讲?在化学中怎么用?
嵇顷泻15728771002 ______ 十字交叉法是进行二组分混和物平均量与组分量计算的一种简便方法.凡可按M1n1 + M2n2 = (n1 + n2)计算的问题,均可用十字交叉法计算的问题,均可按十字交叉法计算,算式为: M1 n1=(M2- ) M2 n2=( -M1) 式中, 表示混和物的某平均量,...

寇群帖3471如何用十字交叉 计算三种不同浓度的混合问题把浓度为20%、30%和50%的某溶液混合在一起,得到浓度为36%的溶液50升.已知浓度为30%的溶液用量是浓... -
嵇顷泻15728771002 ______[答案] 我按自己的理解写的,不是规范的,仿照十字交叉

寇群帖3471用十字交叉法解浓度问题 -
嵇顷泻15728771002 ______ 设甲X% 乙Y% (4X%+6Y%)/(4+6)=62% 同质量(X%+Y%)/2=61% 联立 解得 X=56 Y=66 即甲的酒精浓度56% 乙的酒精浓度66%

寇群帖3471化学十字交叉法的推导?同一物质的甲、乙两溶液的百分比浓度分别为a%、b%(a%>b%),现用这两种溶液配制百分比浓度为c%的溶液.问取这两种溶液的质... -
嵇顷泻15728771002 ______[答案] 应该是m1:m2=(c-b)/(a-c) m1a%+m2b%=(m1+m2)c%直接两边同时除以m2 m1:m2*a+b=m1:m2*c+c 所以m1:m2=(c-b)/(a-c) “m1m2=c-ba-c”应该是＂m1:m2=(c-b):(a-c)