用标准曲线定量的过程

定义

标准曲线（standard curve），是指通过测定一系列已知组分（浓度/含量）的标准物质的某理化性质，从而得到该性质的数值所组成的曲线。标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。它是我们做定量实验中的常用工具，其准确性将会直接影响到实验数据的准确性。

目的

标准曲线的测定可以帮助我们查得待测物质的含量。举个简单的例子，当我们测定可溶性糖的时候，我们无法直接获得含量，这时就需要使用葡萄糖（标准物质）来制作可溶性糖的标准曲线，从而将我们测定的吸光值带入标准曲线中就可以获得可溶性糖的含量了。

依据（GB/T 22554-2010《基于标准样品的线性校准》）

实验条件应与测量系统的正常操作条件相同。

标准物质的组成成分尽量与被测样品的组成成分保持一致。

标准曲线中的浓度/含量需要≥3，最好为4-6个点。

标准曲线中的标准液至少做2个生物学重复，以保证准确性。

标准曲线中的常见问题

Q1：标准曲线中的（0，0）可以随意添加吗？

答：不能。通常的标准曲线的浓度/含量设定一般为0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L……，这其中的0 mg/L与（0，0）是截然不同的。0 mg/L是我们在绘制标准曲线时所说的零管，一般情况下它是用来对仪器调零的，这一点也是确保我们能获得准确数值的第一步。而（0，0）只是有些人臆想出来的数值，他们简单的认为零管的吸光值就应该是0，这种想法是极其不正确的想法。因此，在绘制标准曲线时一定要做好零管，不可随意添加（0，0）。

Q2：标准曲线需要减掉试剂空白来做吗？

答：不需要。仪器测出来标准系列的响应值可以减掉试剂空白或减掉零管的响应值来做，工作中我们也常用零管来做仪器调零。其实没有必要那么麻烦，即使空白或零管有响应值，在构建标准曲线时，我们已经认为该响应值就是0浓度，也就是扣除了这个空白的。

Q3：标准曲线去查含量时是先减空白信号算样品含量还是先算出空白含量相减呢？

答：一般情况下两者皆可以。实验中我们常要减掉空白得到样品含量，根据现有的国家标准，有的推荐先算出空白含量，用样品含量相减，也有推荐先用样品信号减空白信号然后去标准曲线推算含量。有时候这两种算法常常会有很大的差距。其实这种差距往往是低含量水平时才出现，在低含量水平通过标准曲线推算含量时，本身不确定度就很大。

小编在这里推荐大家可以先用样品信号减空白信号然后去标准曲线推算含量，因为这样出来的含量不确定度要小一些，而先算出空白含量再相减就增加了1次标准曲线推算含量时的不确定度，因为好的测量永远是不确定度小的测量。

Q4：空白测出来是负值，该不该减呢？

答：需要减去。空白代表你所选择的空白对仪器响应/信号的影响，当然可能是正方向和负方向的影响，所以理论上讲必须减掉空白。

Q5：如何做标准曲线的检验呢？

答：判断两条或多条标准曲线的差异，须检验线性，截距和斜率三项

（1）线性检验：即检验校准曲线的精密度。对于以4～6个浓度单位所获得的测量信号值绘制的校准曲线，分光光度法一般要求其相关系数R2≥0.9990，否则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格的校准曲线。

（2）截距检验：即检验校准曲线的准确度，在线性检验合格的基础上，对其进行线性回归，得出回归方程y= a+bx，然后将所得截距a与0作t检验，当取95%置信水平，经检验无显著性差异时，a可做0处理，方程简化为y= bx，移项得x=y/b。在线性范围内，可代替查阅校准曲线，直接将样品测量信号值经空白校正后，计算出试样浓度。

当a与0有显著性差异时，表示校准曲线的回归方程计算结果准确度不高，应找出原因予以校正后，重新绘制校准曲线并经线性检验合格。

（3）斜率检验：即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的。在完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异。例如，一般而言，分光光度法要求其相对差值小于5%，而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于10%等等。

Q6：标准曲线的相关系数的有效数字该如何保留呢？

答：依据GB5750.3-20068.2.7：校准曲线相关系数只舍不入，保留到小数点后出现非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小数点后都是9时，最多保留小数点后4位。

Q7：标准曲线可以用同一浓度不同体积的进样来做吗？

答：可以。标准系列一般都是配制不同浓度，进样相同体积来做的（浓度法）。但实际工作中我们还用到同一浓度来进样不同体积的方式来做（体积法），浓度法与体积法的区别在于浓度法中与待测物质存在的溶剂/待测物质的比例与体积法不同。浓度法中溶剂的环境（体积）基本是一致的，这样的好处就是浓度法在判断溶剂（或溶剂中干扰物质）和待测物质的指认上更加容易。体积法中干扰物质也会随标准系列增加，不容易实现待测物质的指认。总之，体积法和浓度法本质上是一致的，但浓度法有容易做好标准曲线、容易实现较大浓度跨度和容易实现待测物质的指认等优点。

Q8：线性范围的最低点和最高点如何确定呢？

答：配制一系列浓度标准，包括0浓度，从低浓度开始拟合当拟合检验出现P>0.05的最高的那个浓度点为止。也有经验说当加入的高浓度点在低浓度点构建的直线方程推算的响应超出±10%范围。关于线性范围的最低点应该是0、检出限或是定量限的问题，小编趋向最低点为0，因为线性范围只是统计学上线性的表现，跟能否准确定量是两方面的问题。但对于一般的理化实验来说，标准曲线在一定浓度范围内为一条直线，因此高浓度点是导致该标准曲线与原线性相差甚大的浓度。

Q9：每次实验都需要测定标准曲线吗？

答：从检测的要求来说是需要的。对于常规的理化检测来说，试剂都是有一定有效期的，因而在检测时大多试剂需要现配现用。另一个是仪器的影响，对于分光光度计来说，它的检测器光能也是在不断变弱的，因此标准曲线也需要重新测定。

Q10：标准曲线查出样品是负值，如何报告结果呢？

答：这种情况下我们一般选择四种方式报告结果：未检出，<检出限，<定量限，<标准曲线第一点所推算的样品浓度。

（1）未检出的全部含义应该是本实验室本仪器本方法未检出。如果没有这些界定，未检出的歧义很多，而且没有提供其它任何可用的信息。所以建议一般不采用这种报告方法。

（2）检出限是定性检出的标志，它是跟空白的统计比较计算出来的。每台仪器，每次测定都有其检出限，检出限计算目前有两大类计算方法：单浓度方法和校正设计法（Anal.Chem.1997,69:3069)，常规采用的单浓度方法需要额外的工作，所以现在趋向用校正设计法，既利用标准曲线直接计算检出限，但检出限I类和II类错误皆控制在0.05。

（3）定量限是可以定量检出的标志，其RSD定为10%，其II类错误比检出限小很多。

（4）<标准曲线第一点所推算的样品浓度，是我们仪器比较可信的测定浓度。

总之，报告<检出限，<定量限，<标准曲线第一点所推算的样品浓度所犯I类和II类错误依次降低，但如果这个报告结果已经超过你要判断的限值，那么你的检测就一点意义都没有了。所以现在的检测单位甚至直接报告小于国家标准规定的限值，从概率统计的角度讲，它犯错误的几率最小，但又解决了客户的检测问题。

小编总结：做好标准曲线是实验成功的第一步，也是最重要的一步。对于标准曲线，我们需要三确定：（1）确定标准物质；（2）确定标准曲线的线性范围；（3）确定标准曲线的准确性。只有这样，我们的实验之路才能一帆风顺的走下去。

诸巧翔1175标准曲线定量分析法的优缺点? -
狐虹庾18179684573 ______[答案] 标准曲线法的优点是:绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单,可直接从标准工作曲线上读出含量,因此特别适合于大量样品的分析.标准曲线法的缺点是:每次样品分析的色谱条件(检测器的响应性能,柱温,流动相流速...

诸巧翔1175请问如何测定甲基橙溶液的吸光度标准曲线?求具体步骤~`想知道是否需要加入某些特殊试剂!急用啊啊!! -
狐虹庾18179684573 ______ 1、 标准曲线的绘制 用100ml的容量瓶配制浓度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/、250mg/L的甲基橙溶液备用. 将上述溶液稀释20倍用7504型紫外-可见分光光度计测定吸光度,在此之前先扫描光谱找出最大吸收峰对应波长为465.2nm,不同浓度对应的吸光度如下表所示: 初始浓度(Co/mg.L-1) 50 100 150 200 250 稀释后的浓度(mg.L-1) 2.5 5 7.5 10 12.5 A 0.180 0.425 0.581 0.777 0.941 T (%) 66.1 37.5 27.1 16.7 11.5 然后用EXCEL或者origin作图就行了.

诸巧翔1175怎样绘制ELISA标准曲线 -
狐虹庾18179684573 ______ 一、做ELISA试剂盒标准曲线样品检测时有几个问题需要注意1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起.2、设置标准曲线样品的标准浓度...

诸巧翔1175相对定量 标准曲线法 弄不明白 求助高手 -
狐虹庾18179684573 ______ 先确定你的直连淀粉和支链淀粉的标准品,做标准品的400-800nm下的扫描图谱,用等吸收点法确定波长和参比波长,然后做这两个的标准曲线.选取测定波长和参比波长时,已经有两个波峰了吧,然后你取其中的一个(假设为直链)波峰(设A1)往上下画直线与支链图谱线相交,沿这个交点(设A2)横着画出与该线的另一个交点(A3),再画出该点与直链图谱线的交点(A4),那么A1和A4就是直链淀粉的两个波长,用同样的方法画出支链的就可以了!有什么解释的不明白的地方你再问吧!

诸巧翔11751710如何计算标准曲线方?得力dL - 1710如何计算标准曲线方
狐虹庾18179684573 ______ 分析化学中的标准曲线 在分析化学实验中,常用标准曲线法进行定量分析,通常情况下的标准工作曲线是一条直线. 标准曲线的横坐标(X)表示可以精确测量的变量(如...

诸巧翔1175标准加入法怎样的过程,如何定量计算 -
狐虹庾18179684573 ______ 1、标准加入法,是将一定量已知浓度的标准溶液加入待测样品中,测定加入前后样品的浓度,加入标准溶液后的浓度将比加入前的高,其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量. 2、标准加入法是一种被广泛使用的检验仪器准...

诸巧翔1175怎么才能使结果接近一条直?在制作标准曲线试验中,怎么才能使结果接
狐虹庾18179684573 ______ 标准曲线(英文为 standard curve)是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质,而得到的性质的数值曲线. 标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系.建立标准曲线的目的是推导待测物质的理化属性. 在分析化学实验中,常用标准曲线法进行定量分析,通常情况下的标准工作曲线是一条直线. 与校正曲线不同,它是以标准溶液及介质组成的标准系列,标绘出来的曲线.校正曲线的标准系列的伴生组分必须与试样相匹配,以便测量结果的准确.只有标准曲线与校正曲线相重合的条件下,才可以用标准曲线来代替校正曲线.

诸巧翔1175什么是分光光度法的标准曲线?绘制标准曲线的意义何在 -
狐虹庾18179684573 ______ 分光光度法中制作标准曲线及影响因素标准曲线是直接用标准溶液制作的曲线,是用来描述被测物质的浓度(或含量)在分析仪器响应信号值之间定量关系的曲线.在分光光度法分析中,被测物质的浓度在仪器上的响应信号值在一定范围内呈直...