白细胞14.73
悬浮细胞培养法: 以淋巴细胞为例
根据血液中各种细胞的比重不同,在血液中加入淋巴细胞分离液,通过离心法,可是一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布,通常会分为4层,从上至下依次为血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层(见图1)。
具体步骤:
1)抽取静脉血2 mL,注含有肝素的无菌试管中摇匀,加入2 mL Hanks溶液稀释;
2)吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中(血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1);
3)水平式离心2000 r/min×20 min;
4)用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的细胞层,用Hanks溶液洗涤两次,每次离心1500 r/min×10 min;
5)弃上清,加RPMI-1640培养液1 mL混匀,取少许进行细胞计数及活力测定;
6)贴壁法区分单核细胞(易贴壁)和淋巴细胞。
注意事项:
1)血液样本须在抽取2小时内使用;
2)注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上,避免破坏其界面;
3)在收集单核细胞和淋巴细胞时,将吸管轻轻插入该层后,沿管壁轻轻旋转吸取细胞。
图1血液中不同比重的细胞分层示意图
组织块培养法:以大鼠肺成纤维细胞为例
具体步骤:
1)铺瓶:乳大鼠经颈动脉放血后,无菌操作取肺脏组织,置于含Hanks液的平皿中漂洗3次,将血凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层,将肺脏组织剪成约1 mm2大小碎片,均匀铺在瓶底,25 mL培养瓶可接种20~30小块;
2)轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内;待其稍干燥后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养;
3)培养24小时后再补液,培养初期移动和观察时要轻拿轻放,开始几天尽量不去搬动,以利贴壁和生长,培养3~5天时可换液,在第7-9天便开始有细胞从组织块周围爬出。
图3 第14天左右细胞融合成大片
消化法:以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为例
具体步骤:
1)无菌条件下取正常分娩胎儿的新鲜脐带,用PBS冲洗脐带至无血色液体流出。
2)从脐静脉一端注入0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液,夹闭脐带两端,置于37℃培养箱中进行消化。15 min后,收集消化液,并加入含20%胎牛血清的M199培养基终止消化,注入M199培养基反复灌洗脐带,收集冲洗液,与消化液一起1000 rpm离心5 min;
3)弃上清液,加入M199培养液(含20%胎牛血清、100 ng/ml VEGF),吹打,使细胞重悬,移入培养瓶中,静置培养;
4)24 h后换液,以后每隔3天换液一次,约7天左右细胞长满汇合,可以传代;
5)使用前可使用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。
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