硝酸与双氧水投加顺序

原理：在变性条件下将待检的 RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 RNA 探针进行反应。

用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

实验方法：

[仪器、试剂、材料]

（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。

（二）材料总 RNA 样品或 mRNA 样品，探针模板 DNA(25 ng)，尼龙膜

（三）试剂：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X 光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-freeKlenow Fragment 和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。

[方法与步骤]

1.用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用 DEPC 水冲洗，干燥备用。处理 DEPC 水(2 L)备用。

2．用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用 DEPC 水冲洗二次，去除 RNAZap。

3．制胶：

1．  称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC 水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液  (需加 DEPC 水补充蒸发的水分)

2．  在通风厨中加入3.6ml 的10＊Denaturing  Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。

3．   将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

4．胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer 盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml\t1×MOPS Gel Running  buffer，在电泳过程中补充蒸发的 buffer。）

5．检查点样孔。

4. RNA 样品的制备

在 RNA 样品中加入3倍体积的 formaldehyde load dye 和适当的 EB（终浓度为10ug/ml）。

混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

5.电泳：

1.将 RNA 样品小心加到点样孔中。

2.在5V/cm  下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min 短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。

3.紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

6.转膜

1．用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用 DEPC 水冲洗。

2．用 RNAZap 擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用 DEPC 水冲洗二次。

3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的 5mm），膜在 Transfer buffer 浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。 4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以 防止漏气。

6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将 transfer buffer 加到胶面和四周。每 隔10min 在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。

8．转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗10秒，去除残余 的胶和盐。

9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于 UV 交联仪中自动交联。

10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)

12．将膜在-20℃保存。

7.探针的制备

1．在1.5ml 离心管中配制以下反应液：模板 DNA(25 ng)\t1ul

Random Primer 2ul 灭菌水 11ul 总体积：14ul

2．95 °C 加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。

3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

 1 0 ×Buff er 2 .5ul

dNTP Mixture 2.5ul

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul

Exo-free Klenow Fragment 1 ul

4．混匀后（25ul），  3 7°C 下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。

5．65 °C 加热5min 使酶失活。

8.探针的纯化及比活性测定：

1．准备凝胶：将1g 凝胶加入30ml 的 DEPC 水中，浸泡过夜。用 DEPC 水洗涤膨胀的凝胶 数次，以除去可溶解的葡聚糖。

2．取1ml 一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器 中装填 Sephadex G-50凝胶。

3．将注射器放入一支15ml 离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g 离心4分钟，凝胶压紧后，补加 Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml 刻度 处

4．100ul STE 缓冲液洗柱，1600g 离心4min。重复3次。

 5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml 离心管置于管中，再将装填了 Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml 离心管。

 6．将标记的 DNA 样品加入25 ul STE，取出0.5ul 点样于 DE8\tpaper 上，其余上样于层

析柱上。

 保留在层析柱中。取0.5ul 己纯化的探针点样于 DE8-paper.

  8． 测比活性。

9．预杂交：

1．将预杂交液在杂交炉中6 8℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

2．加入适当的 ULRAhyb 到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb 杂交液 )，42 ℃ 预杂交4 hr。

10．探针变性：

1．用 10 mM EDTA 将探针稀释10倍。

2．90 ℃热处理稀释后探针10min 后，立即放置于冰上5min。

3．短暂离心，将溶液收集到管底。

11．杂交：

1．加入0.5ml ULTRAhyb 到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

2．42 ℃杂交过夜（14~24hr）。杂交完后，将杂交液收集起来于－20 ℃保存。

12．洗膜：

1．低严紧性洗膜：加入 Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml 洗  膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min 两次。

2．高严紧性洗膜：  加入 High Stringency Wash Solution#2  (100cm2膜面积加入20ml 洗膜溶液)，42 ℃ 摇动洗膜20min 两次。

13．曝光：

1． 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

2． 检查膜上放射性强度，估计曝光时间

3．  将 X 光底片覆盖与膜上，曝光

4．  冲洗 X 光底片，扫描记录结果。

14．去除膜上的探针：将200ml  0.1%SDS（由 DEPC 水配制）煮沸后，将膜放入，室温 下让 SDS 冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

15．杂交结果 \t

 操作应该小心，但不必紧张。用于 RNA 电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去 RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡

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