简述移液管的使用步骤

01 简介

细胞冻存与复苏是一种用于长期储存细胞的技术。在这个过程中，细胞被置于低温环境中，减缓其代谢活动。通过将细胞冷冻保存在液氮中（通常为-196℃），细胞暂时脱离生长状态，但其细胞特性得以保存。当需要时，可以通过复苏将这些冻存的细胞重新激活，以供实验使用。这种方法能够适度地保存一定数量的细胞，防止细胞受到污染或其他意外事件的影响，从而发挥了细胞保种的作用。

02 原理

细胞冻存原理：
细胞冻存的原理在于降低细胞温度至零度以下时，会引起以下变化：细胞器会脱水，细胞内可溶性物质浓度增加，并形成冰晶。

缓慢冷冻的过程可以逐渐使细胞脱水，以防止细胞内形成大冰晶。因为大冰晶可能导致细胞膜和细胞器的损伤和破裂。而快速复苏的目的是防止小冰晶再次结合成大冰晶，即防止冰晶的再结晶过程。

低温保护剂的应用原理：
1. 增加渗透压稳定性：在细胞冻存过程中，加入低温保护剂可以增加细胞的渗透压稳定性，从而减缓细胞在慢速降温过程中的脱水和皱缩现象，显著提高了冻存效率。

2. DMSO的作用：常用的低温保护剂是DMSO（二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂。DMSO能够迅速透入细胞，并提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓了冻结过程。这样一来，细胞在冻结前会透出水分到细胞外部，在细胞外形成冰晶，从而减少了细胞内部的冰晶形成，有效减少了冰晶对细胞的损伤。

03 实验步骤

1 材料准备

1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、废液缸。

3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10 ml）、15 ml 离心管、冻存管（1～2 ml）。

4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5. 试剂：D-Hanks 液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

2 细胞冻存

1. 配制冻存培养液：配制含10% DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。

2. 处理细胞：取对数生长期的细胞，使用胰蛋白酶将单层生长的细胞消化下来，对于悬浮生长的细胞，直接将细胞移至15ml离心管中。

3. 离心：进行1,000 rpm，5分钟的离心。

4. 调整细胞密度：去除胰蛋白酶和旧的培养液，加入适量的配制好的冻存培养液。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后计数并调节冻存液中细胞的最终密度为5×10^6/ml～1×10^7/ml。

5. 分装细胞：将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。

6. 标记冻存管：在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间及操作者。

7. 冻存过程：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；直到-100℃时，可迅速浸入液氮中。另一种方法是将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2小时，然后放入-70℃冰箱中过夜，最后将冻存管移入液氮容器中。

细胞冻存步骤（图片来源于网络）

3 细胞复苏

细胞复苏的步骤如下：

1. 取出冻存管：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动，促使其尽快融化。

2. 处理细胞悬液：从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，将其加入离心管中，并滴加10倍以上的培养液，然后混匀。

3. 离心：进行1,000 rpm，5分钟的离心。

4. 调整细胞密度：弃去上清液，加入含10%小牛血清的培养液以重悬细胞。进行计数，调整细胞密度后，将其接种到培养瓶中，并置于37℃培养箱中，静置培养。

5. 继续培养：次日更换一次培养液，继续进行培养。

细胞复苏方法（图片来源于网络）

04 细胞冻存、复苏注意事项

1. 确保细胞状态良好：在冻存之前，确保细胞具有良好的形态，并且没有污染。

2. 选择适合的冻存液：根据细胞类型选择合适的冻存液，并按照相应的操作规程进行细胞的冻存。

3. 控制细胞密度：要控制好细胞的密度，避免过低或过高影响冻存效果。不同的冻存液针对不同细胞有适当的冻存密度范围，以确保细胞在冷冻和复苏过程中的存活率。

4.尽快冷冻：细胞悬液加入冻存液后尽量短时间在常温放置，因为常温下DMSO对细胞会造成损伤。建议尽快通过程序降温或一步法等方式进行细胞的冷冻保存。

5. 合理存放：细胞长期存放在-80℃冰箱时，建议靠冰箱内侧放置样本，避免开关冰箱导致温度不稳定影响细胞保存效果。

6. 检测存活率：细胞冻存后应取出一管进行复苏，并检测细胞的存活率。为稳妥起见，可在细胞冻存半年后进行复苏培养，并观察细胞生长情况后继续冻存。

7. 温和解冻：使用适当的方法解冻细胞，如将冻存管放入37°C的水浴中直至完全解冻。避免使用高温或暴露时间过长的方法，以减少DMSO对细胞的毒性作用。

8. 匀速摇晃：细胞融解过程应匀速、均一地摇晃以加速融解，同时避免流体剪切力对细胞的损伤。

9.尽快去除DMSO：已融解的冻存细胞应尽快在常温下存放，并尽快离心去除DMSO。

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马春弯1952如何正确使用移液管?移液管中的溶液放出后,在管的尖端尚残留了少量?
祁洋耿18052467052 ______ 吸取时候用洗耳球,液面凹处达到刻度线即可,放出后的残留液在移液管的设计中已经考虑到了他的影响所以不必将残留的溶液吹入容器

马春弯1952移液管残留的液体能否吹出?最好给个移液管的操作规范 -
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马春弯1952什么叫移液管什么叫滴定管.额.最好有图及说明,使用方法. -
祁洋耿18052467052 ______[答案] 移液管是用来量取液体,并且可以从这个地方移到另一个地方.用移液管一般要用吸球同它配合用,定量移取液体时,一般要先吸一点冲洗一下吸管.滴定管一般是用来在化学反应时,逐渐加反应液,然后得到用去的反应量.

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