线粒体内膜合成atp的机制
文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
化学防治是减轻农作物病害危害的有效方法
,在化学防治领域,人们关注的重点集中在杀菌剂的作用机制和病原菌的抗药性机制,而往往忽略病原菌在化学防治胁迫压力下的应答反应机制。
在杀菌剂的胁迫压力下,植物病原菌可以通过多种途径减轻杀菌剂的危害,由禾谷镰孢菌侵染导致的小麦赤霉病是我国小麦生产上最具威胁的流行性病害之一。
21世纪以来,受气候条件变化、秸秆还田等因素影响,我国小麦赤霉病的发生频率明显增加,该病害的流行不仅可造成小麦大幅度减产,还可导致脱氧雪腐镰孢菌烯醇等多种毒素污染谷物,严重威胁人类和动物的健康。
目前,防治小麦赤霉病的药剂种类较少,
提高现有杀菌剂的防治效果对有效防治小麦赤霉病至关重要。
琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂是农业生产上非常重要的一类杀菌剂
,该类杀菌剂通过作用于电子传递链上的复合物II影响病原菌的呼吸链电子传递系统,阻碍其能量的代谢,从而抑制病原菌的生长。
氟唑菌酰羟胺是中化集团开发的新一代的SDHIs杀菌剂,该药剂对小麦赤霉病具有优异的防治效果,2020年1月在我国小麦上登记使用。
前期研究表明F.graminearum对该药剂存在中-高等抗性风险
,建议生产商将该药剂与其他杀菌剂轮换使用或复配使用。
本研究采用转录组测序技术比较分析F.graminearum分别在SDHIs杀菌剂氟唑菌酰羟胺和苯并烯氟菌唑处理后的基因表达特征,从转录组水平揭示F.graminearum对SDHIs杀菌剂胁迫的应答机制,为开发SDHIs杀菌剂的协同增效药剂提供研究思路。
转录组样品制备和文库构建
将菌株PH-1接种到6%绿豆汤培养基,
25℃、175r·min-1培养3d后,收集分生孢子
,取5mL1×105个·mL-1的分生孢子分别接种到100mLYEPD培养基,25℃、150r·min-1培养12h后,分别加入氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑。
氟唑菌酰羟胺处理样品标记为PH-1-F、苯并烯氟菌唑处理样品标记为PH-1-B。由南京集思慧远生物科技有限公司进行转录组测序及初步数据分析。
采用Trizol法提取样品菌丝总RNA,
检测RNA的纯度、浓度、核酸吸收峰
,用带有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA,加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断。
以mRNA为模板合成cDNA,利用AMPureXPbeads纯化cDNA,纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头,用AMPureXPbeads进行片段大小选择。
最后通过PCR富集得到cDNA文库,
使用Qubit2.0进行初步定量
,使用Agilent2100对文库的大小进行检测。
库检合格后,不同文库按照目标下机数据量进行pooling,用Nova平台进行测序,测序读长为PE150。
对RawData进行数据过滤,
去除其中的接头序列及低质量reads
,获得高质量的CleanData,将CleanData与PH-1菌株的基因组进行序列比对,获得MappedData。
基于MappedData,进行插入片段长度检验、随机性检验等测序文库质量评估,根据基因在不同样品的表达量进行差异表达基因分析、GO差异表达基因功能注释、KEGG功能富集等高级分析。
FgFAH基因敲除突变体获得
采用聚乙二醇介导的原生质体转化Split-markerPCR片段法对菌株PH-1的FgFAH基因进行敲除。
以菌株PH-1基因组DNA为模板,
分别对FgFAH基因上下游侧翼序列进行PCR扩增
,将FgFAH基因上下游片段分别一步克隆到PHYG1.4质粒中hyg基因上下游。
以一步克隆获得的阳性质粒为模板,分别扩增包含前半部分hyg的上游目的片段和包含后半部分hyg的下游目的片段,用于原生质体转化。
将菌株PH-1接种至6%绿豆汤培养基中摇培
,3d后将收集的孢子用YEPD培养基萌发11h左右,当菌丝萌发至孢子长度的2~3倍时过滤菌丝。
将收集的菌丝加入酶解液中,酶解2h左右镜检并过滤原生质体,利用STCbuffer稀释原生质体至107个·mL-1。
将原生质体悬浮液100μL,30%PEG40μL
,上下游目的片段各20μL混合并放置冰上孵育30min,加入1mL30%PEG,室温下再孵育5~10min。
加入10mLRM培养基于以上混合物中倒两个平板,原生质体再生培养12~24h后用含有300μg·mL-1潮霉素B溶液的RM培养基覆盖上层,4~7d内长出转化子,将长出的转化子转移到含有潮霉素B的V8培养基上生长2~3d,转到新的PDA平板中。
将FgFAH基因敲除突变体及亲本菌株PH-1分别接种于含不同浓度的氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑的YBA平板中,
以不含杀菌剂的YBA平板做对照,25℃条件下培养4d
,观察敏感性差异并用十字交叉法测量菌落直径,计算EC50值。每处理重复三次。
通过Illumina测序后,PH-1、PH-1-F和PH-1-B分别产生30026821、26277635和25070625个Reads,
总的碱基数平均分别为9008046450、7883290650、7521187500,均大于6291456kb。
为了揭示F.graminearum受到SDHIs杀菌剂胁迫后基因表达特征的变化,本研究通过转录组分析比较了SDHIs杀菌剂处理前后的差异表达基因,通过FPKM方法计算DEGs。
相比PH-1,PH-1-F样品中有2520个基因差异表达显著,其中1374个基因上调表达,1146个基因下调表达,PH-1-B样品中有3959个基因差异表达显著,其中2090个基因上调表达,1869个基因下调表达。
差异基因韦恩图分析表明:
氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑分别处理后的DEGs中
,两者共有的上调DEGs有1180个,共有的下调DEGs有937个,分别占所有DEGs的51.7%和45.1%,表明氟唑菌酰羟胺和苯并烯氟菌唑对F.graminearum有相似的作用机制。
GO功能富集分析显示:共同上调的差异基因中,参与线粒体翻译、有氧呼吸、ATP合成与运输、线粒体呼吸链复合物组成、氧化还原等过程的差异基因表达显著。
表明F.graminearum可能通过增加线粒体电子传递链途径相关酶类基因以及跨膜运输途径相关酶类基因的表达来应对SDHIs类杀菌剂的胁迫,
共同下调的差异基因主要参与生物膜形成、菌丝生长、转录翻译等过程。
线粒体电子传递链相关基因
SDHIs杀菌剂主要作用于病原菌线粒体电子传递链上的复合物II,即琥珀酸脱氢酶或琥珀酸-泛醌还原酶。该酶复合物由黄素蛋白、铁硫蛋白和另外2种嵌膜蛋白的4个亚基共同组成。
此外,
本实验室前期研究发现F.graminearum中存在FgsdhC的同源基因
,命名为FgsdhC2,本研究发现,PH-1-B、PH-1-F样品中基因FGRAMPH1_01T24629、FGRAMPH1_01T18325、FGRAMPH1_01T28127。
表明F.graminearum通过上调琥珀酸脱氢酶亚基基因来维持复合物II的氧化还原作用
,提高琥珀酸脱氢酶的稳定性,应对SDHIs杀菌剂的胁迫。
电子传递链位于线粒体内膜上,由5个复合物组成,SDHIs杀菌剂作用于复合物II,线粒体呼吸链的电子传递途径受到了干扰,与其相关的一系列反应都会发生变化。
线粒体复合物III是一个多亚基复合物,每个复合物III核心包含一个细胞色素b、一个细胞色素c1和一个铁硫蛋白,这3个核心蛋白亚基负责电子的传递以及细胞色素C的还原。
PH-1-B和PH-1-F样品中表达上调的基因中被注释为泛醇-细胞色素C还原酶活性的基因有6个,
包括细胞色素b-c1的铁硫亚基基因及细胞色素b-c1的6、7、8、9和10亚基基因。
复合物III的多个亚基基因上调表达,可能是F.graminearum通过增强电子的接收和向下传递的能力减轻复合物II受到抑制对线粒体呼吸作用的影响。
延胡索酰乙酰乙酸水解酶在酪氨酸代谢途径中扮演重要角色
,其可将延胡索酰乙酰乙酸水解为延胡索酸和乙酰乙酸。
故推测:SDHIs杀菌剂抑制了病原菌琥珀酸脱氢酶的活性,导致病原菌无法将线粒体基质中的琥珀酸氧化为延胡索酸,而FgFAH基因表达上调,可以生成更多的延胡索酸,缓解了SDHIs杀菌剂对F.graminearum正常生理代谢的胁迫伤害。
ATP结合盒转运蛋白和主要协助转运蛋白在生物体内参与了很多重要的生理过程
,比如:转运次生代谢产物、参与胁迫反应等。
本研究发现:F.graminearum在SDHIs杀菌剂处理后,2个ABC基因和4个MFS基因显著上调表达,其中FGRAMPH1_01T13949基因已经被报道与多重抗药性相关。
推测F.graminearum通过上调表达ABC和MFS转运蛋白,
增强对药剂的外排
,减少药剂在病原菌体内的积累量,从而降低杀菌剂对病原菌的毒性。
染色质重塑复合物SWI/SNF在许多真核生物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。SNF2是SWI/SNF复合物的核心亚基,其HSA结构域能够显著抑制染色质重塑活性,在抗胁迫过程中起负调控作用。
本研究发现与SNF2家族相关的5个基因下调表达
,这些基因在SDHIs杀菌剂处理后表达下调,表明F.graminearum通过增强染色质重塑活性来应对SDHIs杀菌剂的胁迫。
菌株PH-1和FgFAH基因敲除突变体ΔFgFAH对氟唑菌酰羟胺的EC50值分别为0.008和0.002μg·mL-1,对苯并烯氟菌唑的EC50值分别为0.073和0.031μg·mL-1,FgFAH基因敲除后的F.graminearum对SDHIs杀菌剂的敏感性增强。
这表明FgFAH参与了F.graminearum对SDHIs杀菌剂胁迫响应调控
,菌株PH-1和FgFAH基因敲除突变体ΔFgFAH在PDA培养4d时菌丝生长直径分别为6.10和6.95cm。
本研究利用转录组测序技术分析了F.graminearum受到SDHIs杀菌剂胁迫后基因表达特征的变化。
结果表明,
F.graminearum可通过调节线粒体电子传递链复合物相关基因
、泵转运蛋白以及染色质重塑复合物SWI/SNF的表达来缓解或减轻胁迫危害。
发现F.graminearum在SDHIs杀菌剂处理后多个SWI/SNF复合物相关基因表达量下调,它们是否调控了多重抗药性相关基因的表达。
从而降低了药剂对病原菌的毒性,
还需要进一步的研究
,本研究中下调表达的SWI/SNF基因中,FGRAMPH1_01T19417基因敲除后菌丝生长和致病力受到严重抑制。
还发现了其他一些有意义的基因表达量发生了改变,比如:FGRAMPH1_01T11901是一个交叉过敏原基因,该基因在SDHIs杀菌剂处理后显著下调表达。
这表明SDHIs杀菌剂不仅能够抑制F.graminearum的菌丝生长还能够抑制其过敏原基因的表达,
不同真菌的过敏原基因具有交叉反应
,这可为医学上防治真菌过敏的药物研究提供新的思路。
桂于菡667有氧呼吸中葡萄糖可以产生ATP,那ATP是在哪里合成的呢还有ATP与ADP不是说同增减的么?在线粒体内膜有大量ATP生成,那ADP会大量增加么?ADP又... -
陈振卿13378444386 ______[答案] ATP合成: 细胞质基质、线粒体、叶绿体. 原核生物是:细胞质基质.对于真核生物,ATP产生于:细胞质基质(无氧呼吸和有氧呼吸的第一阶段)和细胞器(线粒体和叶绿体). 不是,ATP施放能量变成ADP,ADP得到能量变成ATP. 理论上会降低. ...
桂于菡667线粒体内膜形成了许多嵴,上面附有大量基粒.经研究发现,基粒是合成ATP所需要的多种酶的复合体.这可以表明,线粒体内膜的重要功能之一是 -
陈振卿13378444386 ______[选项] A. 使物质定向运输 B. 控制物质出入线粒体 C. 合成酶蛋白和ATP的场所 D. 提供酶的支架,参与反应调控
桂于菡667生物问题——线粒体中ATP的生成 -
陈振卿13378444386 ______ 是这样的百,你可以百度下氧化电子传递链和ATP合成酶,然后我再说明一下哈~ NADH和FADH等氧化产物把电子传入电子传递链,通过度电子的传递,将线粒体内膜里面的质子抽到外面去,造成内膜两边的质子梯度.这些电子会在复合物IV处将氧作为最终电子受体,形成水. ATP合成酶是位于线粒体内专膜上的,它有一个质子通道和ATP的合成属位点,内膜两边的质子在浓度梯度的驱动下,通过质子通道,抽动ATP合成位点的旋转,将ADP和Pi合成ATP.(就像水通过水车转动磨盘磨面粉一样)
桂于菡667线粒体是怎样利用丙酮酸产生ATP的?请详细说一下 -
陈振卿13378444386 ______ 丙酮酸和水分解产生H和二氧化碳,也会产生少量热量.然后产生的H和吸入的氧气发生反应,生成水,这个过程产生的热量最多.这两个过程都是线粒体内膜进行,产生的热量就和ADP发生一系列变化,就可以生成细胞的直接能源物质ATP!望采纳,完全依靠记忆想起来的.😂😂😂上了大学忘了差不多了
桂于菡667(2013•长沙模拟)如图为化学渗透学说解释线粒体内膜上ATP形成的机理:线粒体内膜上通过呼吸链进行电子传递使NADH脱下H+进入到内膜外的腔中,造成... -
陈振卿13378444386 ______[选项] A. 自由扩散 B. 协助扩散 C. 主动运输 D. 渗透作用
桂于菡667机体内Atp再合成途径有什么 -
陈振卿13378444386 ______[答案] ATP可通过多种细胞途径产生.最典型的如在线粒体中通过氧化磷酸化由ATP合成酶合成,或者在植物的叶绿体中通过光合作用合成.ATP合成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸.每分子葡萄糖先在细胞质基质中由酶催化产生2分子丙酮酸(C3H4O3)同时产...
桂于菡667人体内能生成ATP的细胞器是线粒体,为什么啊? -
陈振卿13378444386 ______ 核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒(ribonucleoprotein particle),主要由核糖体RNA(rRNA)和蛋白质构成,其功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链,所以核糖体是细胞内蛋白质合成的分子机器.它主要存在于细胞质当中,也可以存在于线粒体内,但是他不能参与ATP的合成,相反它在合成蛋白质的同时还要大量消耗ATP. 线粒体之所以能生成ATP,并且是细胞合成ATP的主要细胞器,其关键在于它的内膜上有电子传递系统,将生物氧化释放的能量转化为ATP.另外,它还有大量的氧化酶系,这也是它产能的一个重要因素. 这都是生物进化,生命体各部分分工精细化的结果.
桂于菡667ATP在什么地方形成 -
陈振卿13378444386 ______ 原核生物没有线粒体,所以它的ATP在细胞质内合成,这里不加讨论了.真核生物.动物是在线粒体内膜上合成,植物是在线粒体内膜和叶绿体类囊体膜内(相当于内膜上).之所以不选择在线粒体或者叶绿体的机制内合成是由原因的,其一,在成熟的线粒体或者叶绿体内,机制所占的空间其实是很小的,其二,ATP是机体的直接能源物质,消耗量大,合成速率要求要高,这就需要一个专一的环境来合成,基质是一个液相、流动的体制,酶分子跑来跑去,方向不断变化,不利于底物和酶的结合,其三,ATP的合成与许多反应相偶联,是一个连续的过程,牵涉到不止一种酶,这种有序、复杂的过程通过将酶固定在内膜上显然是有重大意义的.谢谢!
桂于菡667ATP在哪里合成 -
陈振卿13378444386 ______ 在原核生物中ATP是在细胞膜内膜上合成的.在真核生物中,主要在线粒体中合成;细胞质基质中也可合成ATP,就是糖酵解(有氧呼吸第一阶段)过程的产物.绿色植物也可在叶绿体类囊体膜上合成ATP,但这些主要提供给光合作用了.ADP也可与高能磷酸化合物反应生成ATP(在细胞质基质中反应)
桂于菡667在人体骨胳肌细胞中ATP的合成场所是
陈振卿13378444386 ______ ATP在线立体的质粒上有合成