组织培养病毒的方法有哪些

因慢病毒载体能有效地转导靶细胞，如造血干细胞和T细胞，在细胞和基因治疗中的应用越来越广泛。目前cGMP级慢病毒载体的大规模生产受到使用的HEK293T细胞的黏附性和血清依赖性的限制。

2020年6月，圣犹达儿童研究医院载体开发和生产实验室的Robert E. Throm研究员带领团队在Molecular Therapy - Methods & Clinical Development期刊上发表了题为“Production of Lentiviral Vectors Using Suspension Cells Grown in Serum-free Media”的文章。文章中报道，研究团队开发了一种新的生产方案，通过使用市购和化学定义的无血清培养基，使HEK293T细胞在悬浮中生长。利用优化的转染条件，将质粒DNA的需要量减少了50%，从悬浮细胞中产生了滴度相当于HEK293T细胞生产系统的慢病毒载体。

一、获得SJ293TS细胞系

为了将贴壁HEK293T细胞系驯化为悬浮生长细胞系，研究团队使用了市售的Freestyle 293 (Thermo Fisher Scientific) 无血清培养基，采用Freestyle 293 + 10% FBS的培养基代替DMEM + 10% FBS的293T标准培养基培养细胞，并将细胞分别培养至未组织培养处理培养皿和组织培养处理培养皿上。研究团队以1周为间隔减少培养基中的血清量，每周传代3次。4周后，细胞在仅有Freestyle 293存在的情况下悬浮生长。直接在未组织培养处理的培养皿上驯化的细胞比在组织培养处理的培养皿上驯化得到的细胞聚团少，这两种方法最终都成功地使HEK293T细胞在Freestyle 293中悬浮生长。最后将驯化得到的细胞系命名为SJ293TS，然后在震动培养箱​中培养(37℃，8% 二氧化碳，125 rpm)，形成主细胞库。复苏细胞，以在5e5cells /mL密度进行培养，每24小时计数一次，培养2天。结果表明，SJ293TS细胞每23.4±2.7h倍增，细胞密度达到3e6cells /mL，且细胞活率未受影响。SJ293TS细胞系的后期培养将保持在3e5- 3e6 cells /mL之间，每2-3天传代一次。

二、瞬时转染方法的优化

图1. SJ293TS细胞制备慢病毒载体的转染优化* * * p = 0.0002, p = 0.0167, * * * p = 0.0053, p = 0.0193 * * * *，n = 3。数据以平均值±标准差表示。

研究团队使用一个表达GFP的慢病毒来优化转染条件(vector CL40-MND-GFP)，并以20mL体系培养在125ml摇瓶中以便检测。首先，研究团队测试了转染时细胞密度的影响情况。基于HEK293T细胞慢病毒包装进行转染时细胞密度约为1e6 cells / mL的经验，将转染SJ293TS细胞时的密度控制在0.5 - 3e6 cells / mL，采用两种不同的量添加转染的质粒DNA，每1e6 cells 采用0.55和1.1 μg DNA。转染24小时后，离心弃上清，将细胞重悬于20ml新鲜培养基中。转染48小时后收集上清液，并使用HOS细胞进行滴度测定。如图1所示，使用以0.55 μg DNA / 每1e6 cells 转染的SJ293TS细胞的慢病毒产量受到接种密度的显著影响，其中接种密度为2e6 cells/mL的慢病毒滴度最高。

接下来，团队研究了聚乙烯亚胺(PEI)和质粒DNA之间形成最佳多聚体的时间。制作单个主转染混合物并孵育30分钟。在不同的时间点，从转染混合物中取样，用于转染SJ293TS细胞，生产慢病毒并检测滴度。虽然未从实验结果中观察搭配显著差异，但孵育5分钟后进行慢病毒包装而生产得到的慢病毒滴度达到最大值，且孵育时间较长则倾向于降低滴度。因此，SJ293TS细胞的所有后续转染均在PEI与质粒DNA孵育5min后进行。

三、SJ293TS细胞与其他细胞基于HEK293的细胞系生产慢病毒的比较

表1. HEK293T或SJ293TS细胞生产的慢病毒载体的滴度

为了评估SJ293TS细胞系在悬浮系统的中的慢病毒产量，研究团队比较了在5L摇瓶中SJ293TS的慢病毒产量与在10层细胞工厂系统中的亲本HEK293T细胞的慢病毒产量(均为1L)。为了进行比较，各制备了三种不同的临床相关慢病毒：两种是含有带有荧光的针对人BCL11A的shRNA-miR（SJL118和SJL121），另一种含有第二代抗CD19嵌合抗原受体的慢病毒（αCD19-CAR），如表1所示，HEK293T-10层细胞工厂系统生产的慢病毒滴度分别比SJ293TS-5L摇瓶系统生产的慢病毒高1.8倍、1.4倍和2倍。

图2. SJ293TS、病毒产生细胞(VPCs)和Expi293F作为慢病毒载体产生细胞系的比较从SJ293TS、病毒生产细胞(VPCs)或Expi293F细胞中生产pCL40-MND-GFP(黑色)或pCL30-V5m3-Sardinia(灰色)，规模为20 mL。*p = 0.0252， **p = 0.0239。N = 3。数据以平均值±标准差表示。

接下来，研究团队将SJ293TS细胞系与市售的两种基于HEK293的悬浮细胞系进行了比较，即Expi293F细胞和病毒产生细胞。三种细胞系以20mL的体系进行慢病毒包装以生产慢病毒（CL40-MND-GFP）。除了GFP-LV外，还比较了一种更复杂的慢病毒生产，即表达人类g-珠蛋白基因的V5m3-Sardinia。如图2所示，两种慢病毒的滴度结果表明，SJ293TS细胞系生产的慢病毒的滴度是病毒产生细胞或Expi293F细胞的10至25倍。

四、SJ293TS细胞慢病毒生产方法的改进

为了提高SJ293TS细胞系用于cGMP级慢病毒生产的产量和适用性，研究团队对其慢病毒生产工艺进行了优化。研究团队使用RNA-OUT技术制备质粒以代替传统的以抗生素筛选来制备质粒。使用RNA-OUT取代了辅助物上的β-内酰胺酶表达，并转移了质粒，这有助于减少质粒骨架的大小。该团队还通过用等体积的新鲜培养基稀释转染细胞来减少转染后的额外操作。

研究团队还通过优化用于瞬时转染SJ293TS细胞的质粒比例来提高慢病毒的产量。结果表明，与前期使用的12:6:2:0.25的质粒比例相比，目的质粒:HIV-1 gagpol:Env:HIV-1 rev的比例为14:4:2:0.25时，得到的表达第二代抗CD123嵌合抗原受体慢病毒（SJL644）滴度增加了1.7倍。使用每皮克HIV-1 p24含1e4个物理粒子来计算，每TU的物理粒子从平均319个显著减少到170个（p=0.0071）。因此，新的质粒比例被用于后续SJ293TS系统的慢病毒生产。

图3. SJ293TS细胞持续高滴度生产临床相关慢病毒载体及与HEK293T细胞衍生滴度1-L的比较(A)连续传代4个月以上的SJ293TS细胞周期性生产VSV-G假型SJL643的未处理上清液(灰色实线带圆圈)和纯化后的慢病毒载体制剂(黑色虚线带三角形)的滴度。(B)从1 L转染的HEK293T细胞或SJ293TS细胞中获得的总慢病毒载体转导单位(TUs)。*p = 0.02554。HEK293T细胞n = 3, SJ293TS细胞n = 6。数据以平均值±标准差表示。

通过连续传代SJ293TS细胞4个月，使用另一种表达第二代抗CD123嵌合抗原受体的临床慢病毒（SJL643）进行周期性1-L 慢病毒生产，评估了SJ293TS慢病毒生产工艺的稳定性。如图3A所示，结果表明慢病毒原液与纯化液的滴度具有高度可重复性，平均值分别为5.3±1.9e7和1.2±0.4e9TUs/mL。如图3B所示，与在HEK293T细胞-10层细胞工厂系统中使用氨苄青霉素抗性质粒生产相同的慢病毒做比较时，从SJ293TS系统中获得慢病毒的滴度高1.8倍，具有统计学意义，p=0.002554。

五、SJ293TS细胞慢病毒的下游工艺

图4. SJ293TS慢病毒载体生产图

SJ293TS细胞慢病毒的下游工艺如图4所示，在慢病毒生产过程中，转染后24小时将全能核酸酶添加到生产体系中，以减少上清液中的质粒和基因组DNA。收获慢病毒上清后，使用按比例缩小的cGMP级工艺纯化由SJ293TS系统生产的1L 慢病毒样品，对其进行澄清化处理，继而进行阴离子交换色谱、切向流浓缩过滤和0.22 μM过滤，以减少终产品中宿主细胞蛋白质和DNA的污染，提高慢病毒终产品中TU的浓度，并确保最终产品的无菌性。研究者将这些处理方法应用于该机构的1-L研究级慢病毒制剂生产纯化（n=138）。0.22 μM过滤后，慢病毒TU的平均总回收率为原液中总TU的55% ± 14%。与团队前期使用HEK293T细胞-10层细胞工厂系统进行慢病毒生产纯化得到的样品相比，产量提升了2倍。

表2. 转导后第4天和第7天的HOS细胞载体拷贝数

研究者对四种不同的1-L 慢病毒样品（纯化前后）进行ddPCR分析，以检测是否存在质粒污染。结果如表2所示，尽管在所有测试的样品中都检测到了质粒DNA，但收获时上清液中的质粒拷贝数比转染时添加的质粒减少了3-4 logs（p=0.001），且纯化前后没有显著变化（p>0.05）。这些数据表明，在慢病毒生产过程中用相对较低数量的全能核酸酶处理慢病毒收获液能显著降低样品中的质粒残留量。且残留的质粒DNA不太可能影响慢病毒的滴度结果。为了验证这一点，研究者对用非浓缩或浓缩慢病毒制剂转导的HOS细胞的基因组DNA进行了ddPCR。在第4天和第7天收获的HOS细胞中，ddPCR均未检测到质粒信号。

六、SJ293TS源性LV在临床基因和细胞治疗中的适用性

图5. SJ293TS慢病毒载体高效转导健康人T细胞。用SJ293TS细胞制备的四种不同的慢病毒载体(由两种不同的抗cd123 - car慢病毒载体组成)在MOI为25时转导来自单个健康供体的CD4+和CD8+人T细胞。转导后7天，流式细胞术检测CD123 CAR的表达(A);同时测定细胞总数、活率(B)和载体拷贝数(C)。

在该研究团队的工艺开发过程中，已经生产了临床相关的慢病毒，因此便想测试这些慢病毒如何转导靶细胞群，主要是人T细胞或CD34+阳性HSC。如图5所示，SJ293TS细胞系生产的慢病毒能有效转导健康供体来源的人T细胞。使用含有两种不同的第二代抗CD123-CAR慢病毒以及pSJL605和pSJL643的四种不同的慢病毒以25的MOI转导原代人T细胞。转导后7天，所有四个T细胞群在表面表达高水平的抗CD123CAR，并保持与未转导细胞相当的扩增水平和活力（图5A和5B）。四个不同慢病毒批次之间每个细胞的平均VCN非常一致，证明了SJ293TS生产系统的的可重复性（图5C）。

接下来，研究者测试了已知对VSV-G假型慢病毒具有耐药性的人CD34+细胞的转导效率。与原代T细胞的结果类似，产自SJ293TS生产系统的LV有效地转导了从不同健康供体获得的外周血的人CD34+细胞。为了证实一批特定的慢病毒不会产生有效的转导，研究者生产了两种不同的慢病毒，每一个都表达一个shRNA和一个来自人血红蛋白基因座控制区DNA超敏位点HS2和HS3的荧光团，以及b-球蛋白启动子（SJL425）和具有BCL11A增强子的人糖蛋白A启动子（SJL319）。以50的MOI转导CD34+细胞，随后将其接种到MethoCult中，以评估来自造血谱系细胞的VCN。12天后，将MethoCult菌落汇集在一起，并通过ddPCR测定平均VCN。SJL425在两个不同的供体身上获得了0.89和2.71的VCN；SJL319的两种单独制剂在第三个供体上显示出0.76和1.05的VCN。数据有限，但在使用SJL425慢病毒的MethoCult培养物中观察到的近3倍的VCN差异可能反映了供体允许性的差异。

七、BaEV-R-less假型慢病毒

图6. SJ293TS和HEK293T细胞产生的总BaEV - R -less伪型慢病毒载体转导单位。当使用等量的转染DNA时，SJ293TS细胞产生的TUs比HEK293T细胞多20倍。*p = 0.0054。N = 4。数据以平均值±标准差表示。

另一种包膜糖蛋白，狒狒内源性逆转录病毒（BaEV），已被证明可以极大地改善人B细胞对VSV-G假型慢病毒的转导抗性。但这种包膜蛋白的使用存在局限性，贴壁HEK293T细胞在BaEV假型慢病毒生产过程中形成合胞体，导致生产得到的慢病毒滴度低。研究团队推断，BaEV假型慢病毒在悬浮系统中生产可能会减少细胞合胞体的形成，并增加BaEV假型慢病毒滴度。为了检验SJ293TS细胞是否可以提高BaEV-R-less假型慢病毒的产生量，团队比较了HEK293T和SJ293TS生产的表达GFP的慢病毒(CL40-MND-GFP)的滴度。其中转染SJ293TS和HEK293T细胞的体系分别为20 mL和10 mL。由于SJ293TS细胞转染的DNA浓度是HEK293T细胞的一半，因此转染到每个细胞系中的DNA总量是相同的。如图6所示，使用相同量的转染DNA，SJ293TS细胞生产的慢病毒的TU是HEK293T细胞生产的慢病毒的20倍。此外，从SJ293TS细胞以1L规模生产三种不同的BaEV-R-less假型慢病毒，并通过使用第五章所述的下游处理浓缩50倍。根据慢病毒的不同，终产品的滴度在0.2到2e8TUs/mL之间，总流程平均总得率为33%±2.9%。这些数据表明，SJ293TS可用于生产滴度高于贴壁HEK293T细胞的BaEV-R-less假型慢病毒，并可使用离子交换和切向流过滤进行纯化。

总结：慢病毒用于临床的一个关键考虑因素是其转导临床相关靶细胞的能力。SJ293TS细胞来源的慢病毒能够有效转导粒细胞集落刺激因子动员的志愿者外周血和健康供者来源的外周血T细胞来源的CD34 +细胞。以上数据表明，SJ293TS生产系统代表了慢病毒生产的重大进步，因为它稳定，不需要动物衍生试剂，并且适合真正的大规模生产，同时提高了慢病毒的产量和纯化效率。研究团队在未来会将工作主要集中在通过使用5 L规模的搅拌槽生物反应器进行SJ293TS生产系统的放大试验。

参考文献：Bauler, Matthew , et al. "Production of Lentiviral Vectors Using Suspension Cells Grown in Serum-Free Media." Molecular Therapy — Methods & Clinical Development 17(2019).
DOI: https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.11.011.

来源：“荣谷生物”GZH，作者-melody 。
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