菌落蔓延图片

来源：“六扇门study”GZH

本期分享的内容来自3月CBIFS大会上福建省疾病预防控制中心马群飞老师分享的《GB4789.2 菌落总数测定方法验证》报告，马老师在报告中分享了许多关于“菌落总数测定中的误操作及避免方法”，小六印象深刻，拿着本本做了许多记录，马上分享给小伙伴们哈！

菌落总数测定的影响因素较多，在操作过程中，出现的细微变化都可能影响最终计数结果。所以，检验者准确执行标准的工作能力非常重要，这样可以将许多误差减少到最低限度。

我们操作过程需要考虑的因素有哪些？

1、技术问题
如：环境条件要求、解冻化冻方式、样品处理方式、平皿堆叠层数、菌落数量异常、菌落蔓延干扰、颗粒干扰计数等。

2、管理问题
如：不确定度评定、标准物质应用、培养基的验收、检毕物品废弃、其他标准方法、方法验证确认、质量控制频次等。

3、报告方式
如：执行方法标准、超出常规精度、报告符合规定。

接下来，小六重点分享马老师在报告中提出需要关注的几点内容。

特别注意点解析

加样混匀方式

重点关注培养皿开启、琼脂恒温、摇匀方式、培养基量、水平放置等是否符合标准规定。
例如，平皿要水平放置，因为可能后续计数使用的是半个平板来计数（如有蔓延菌生长），所以要水平放置凝固。

培养条件要搞清楚

6.2.1 水平放置待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。水产品30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h……
重点来了，许多小伙伴搞不清楚水产品和水产制品的区别哦，一定要准确判断类别，避免法律纠纷。

GB 10136-2015《食品安全国家标准-动物性水产制品》中规定，以鲜、冻动物性水产品为主要原料，添加或不添加辅料，经相应工艺加工制成的水产制品称为动物性水产制品。
由此可见，水产品和水产制品是不同的概念。

GB4789.2-2022中涉及的水产品应为带有原生菌群的未经加工的水产品，30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h；而水产制品的培养条件是36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。

稀释度问题

使用单个稀释度，仅限于对这个样品的微生物状态和防腐剂、抑菌物质等状态，有足够的把握时候才可以用！
例如：含有抑菌成分的产品在一定稀释度范围内，会因为抑菌成分浓度的下降，使得微生物的生长繁殖不再受到干扰，从而表现出“越稀释菌越多”的现象。这类产品需要做多个稀释度来获得更准确的结果。

产品中的微生物数量是一定的，因此在某个稀释度下计数结果会达到峰值，随后下降。此时峰值所对应的稀释度以下的浓度梯度就可以认为是正常生长的稀释度，在该区间内进行产品的菌落总数测试即可。

检验环境的要求不可忽视

食品样品检验应在洁净区域进行，洁净区域应有明显标示。
无菌效果应至少每两周验证一次。
美国FDA要求微生物检验-工作台面亮度足够，操作时，同时测定工作区空气沉降菌（15 min暴露，菌落数不能大于15 CFU/皿）。

自动化、标准化设备的应用
降低实验误差，提高效率

微生物检验自动化的实现，能够显著增加日检样数量，大大减少了操作污染和判读误差，直接提升了方法的重复性和再现性，同时，缩短检验周期，降低生物安全风险，并使检验结果能够真正实现全程记录和过程追踪，质量控制有据可查。

平板计数琼脂倾注温度如何
保持在46℃~50℃？

按GB4789.2-2022的要求，平板计数琼脂培养基倾注时的温度应保持在46℃~50℃（可放置于４８℃±２℃恒温 装置中保温），由于过高的温度会造成微生物的热损伤，而过低的温度又会导致培养基过快凝固，影响倾注效果和计数，因此建议用恒温装置（如恒温水浴锅等）保持培养基的温度。

按GB 4789.2-2022的要求“可将培养基放置于48℃± 2℃恒温装置中保温”，注意靠空气传热的培养装置都不能用，恒温装置温度设置为48℃为佳。
（如果我们恒温箱设定了50℃，会出现±1℃偏差允许，51℃可能就超过标准规定了，设定为48℃为佳。）

此外，CNAS-CL01-A001-2022中提到，对结果有重要影响的仪器的关键量或值，应纳入设备的校准/检定计划；如果温度直接影响分析结果，实验室应监控这类设备的运行温度。倾倒时培养基的温度对实验结果有一定的影响，因此建议定期对恒温装置定期进行校准。

正确使用培养箱很重要

如果采用隔水式的恒温培养箱，不能直接将平板放在培养箱底层。因为底层温度是高于设定空气温度的（工作原理是靠加热使空气变热）。

ISO7218 食品和动物饲料的微生物学 微生物学检验的通用规则规定，平板叠放不超过6块！

如果使用测试片需要注意什么？

如果使用菌落总数测试片，并建议补充作业指导书。

实验室应需要识别该方法是否能被检验人员直接使用，当其内容不便理解，规定不够简明或缺少相关信息，方法中有可选择的步骤时，应编制作业指导书，以确保检验人员使用该方法的一致性。
如：编制技术性验收操作细则，填写技术性验收原始记录，证明测试片定量结果准确（使用定量标准物质或者用其他实验室质控手段证明）。

作业指导书里还需要包括什么情况下使用测试片方法。因为按照CNAS要求，如果用户未指定方法，实验室应选择适当的方法，并通知用户。

如何应对菌落蔓延情况？    ​

GB4789.2-2022删除了“报告菌落蔓延”的条款，但一些含有芽胞菌、铜绿假单胞菌的样品，无法避免菌落蔓延。以下几点操作检验，或许有帮助：
（1）加样后，要尽快倾注琼脂，倾注后，不要急于封盖，否则容易形成水汽，凝固后，再次覆盖一层琼脂；
（2）这类样本也可以选择用测试片，使用添加TTC的菌落总数测试片​，可以抑制大多数菌落的蔓延，有助于观察计数；但少数微生物，如部分芽胞杆菌等可能液化凝胶，形成扩散的菌落，导致无法正常计数，选择产品之前要多进行实验验证。

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