谷氨酰胺致癌是真的吗

原名：Oncogenic Fatty Acid Metabolism Rewires Energy Supply Chain in Gastric Carcinogenesis

译名：致癌脂肪酸代谢在胃癌发生中的能量供应链重组

期刊：Gastroenterology

IF：29.4/Q1

发表时间：2022.1

作者：Yoonkyung Won

摘要

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发展是从癌前病变到异型增生和腺癌的癌变过程，而肿瘤基因的激活可以推动这一过程。代谢重编程被认为是癌细胞生长和增殖的关键机制。然而代谢变化如何促进癌症进展尚不清楚。因此，本研究构建了一个新型GCK小鼠模型（Gif-rtTA;TetO-Cre;KrasG12D），研究了胃癌发展过程中的代谢动态，研究发现仅在分泌酶原的主要细胞中激活Kras就可驱动胃癌的完整谱系，同时代谢重塑是异型增生细胞高能量需求的必要适应，对肿瘤细胞的生长和存活至关重要。

研究材料与方法

通过多西环素处理的GCK小鼠，诱导Kras基因在主细胞中的活性表达，同时对GCK小鼠的胃部进行组织学切片检查，免疫荧光染色，使用MALDI成像质谱。

结果

1、活性Kras基因在胃主细胞中的表达可导致化生和高度异型增生的发生。

通过多西环素处理的GCK小鼠，诱导Kras基因在主细胞中的活性表达，同时对GCK小鼠的胃部进行组织学切片检查，免疫荧光染色。结果在10-14周内GCK小鼠发展出癌前病变和高级别异型增生（图1A）。

HGD显示了发育异常腺体的细胞学特征，包括细胞极性丧失、有丝分裂增加、假分层和突出的核仁，所有这些特征在人类患者中常见（图1B）。此外，Kras诱导的胃在化生和发育异常阶段腺体宽度增加（图1D）。

该研究还观察到HGD发育异常细胞顶膜中另外两种标记物的表达:CD133（一种促进腺癌发展的发育异常干细胞标记物）和CEACAM5癌胚抗原相关细胞粘附分子（一种人类发育异常和胃腺癌标记物）（图1K和L）。细胞增殖区和水平扩展至HGD的整个腺体（图1M和N），与CEACAM5阳性发育异常细胞的分布一致（图1M和N）。此外，研究观察到紧密连接的主要结构分子claudin 3在LGD和HGD的基底显著减少，这表明通过改变紧密连接结构，发育异常腺体的细胞极性和结构发生了变化（图1O和P）。因此，这些数据表明，仅在主细胞中激活Kras足以驱动HGD的致癌过程，并伴随细胞谱系进化的动态变化以及腺体结构的构建变化。

图1 : 胃主细胞中Kras激活诱导胃癌发生的关键阶段。（A）在多西环素治疗后多次从GCK小鼠胃获得的H&E染色图像:幽门化生（PM；2-3周）、In-IM（incomplete intestinal metaplasia不完全肠化生）（5-6周）和LGD/HGD（10-14周）。（B）箭头表示在HGD观察到的发育异常的细胞学特征。（C）GCK胃中腺体类型的比例。在第2至3周（第5周）、第5至6周（第8周）和第10至14周（第10周）检查了近端区域的100个腺体。（D）GCK胃腺体宽度的测量。每组共检查100个腺体，每组3只小鼠，每个点表示腺体的宽度，Unt，未治疗。（E）SPEM细胞系的CD44v9（红色）和水通道蛋白5（AQP5，绿色）的免疫荧光染色。（F）对CD44v9或AQP5或两者的阳性细胞进行定量。每组共检查100个腺体，每组3只小鼠。（G）IM细胞的TFF3染色（红色）。（H）TFF3表达腺体的定量。（I）TROP2染色（绿色）。（J）TROP2表达腺体的定量。（K）CEACAM5染色（红色）和Ki-67（绿色）。（L）CEACAM5表达腺体的定量分析。（M）磷酸组蛋白3（pHH3；红色）和Ki-67（绿色）。箭头表示pHH3和Ki-67的阳性细胞。（N）每个腺体Ki-67阳性细胞的定量。每个点表示每个腺体的Ki-67阳性细胞。（O）紧密连接蛋白3（CLDN3）的IF染色（绿色）。（P）CLDN3表达缺失的定量，每个点表示每20人中CLDN3阴性腺体的百分比。

2、在化生进展为发育异常期间，代谢重编程启动脂肪酸代谢。

该研究使用MALDI成像质谱技术，分析了与主要代谢途径相关的300种关键代谢物，包括糖酵解和FA、磷脂和谷胱甘肽代谢。然后，通过空间分布和相对定量的原位可视化，选择了化生或发育异常阶段或两者都丰富的代谢物（图2B）。己糖二磷酸酯，糖酵解途径相关代谢物，最初在幽门化生的胃中升高，并在化生进展过程中逐渐降低（图2B–D）。相反，长链脂肪酸在化生进展过程中有差异地积累。

软脂酸是人体长链脂肪酸中最常见的饱和脂肪酸。尽管软脂酸在正常胃中含量丰富，但其水平在幽门上皮化生中显著降低，然后在肠化生和HGD中升高（图2E和H）。特别是一种独特形式的单不饱和脂肪酸（MUFA；游离脂肪酸【FFA】20:1）（图2G）在化生过程中逐渐增加，并在HGD大量积累（图2F和H）。此外，这种代谢物的积累在发生发育异常细胞谱系转化的腺体底部最为明显（图2H）。值得注意的是，油酸酯（18:1）在胃中也很丰富（图2H），油酸酯是一种众所周知的由棕榈酸生成的MUFA。然而，油酸积累与化生进展之间没有相关性。

一种多不饱和脂肪酸（PUFA，FFA 22:4）也显示出与MUFA（FFA 20:1）相似的累积模式。然而，这种PUFA（FFA 22:4）使用亚油酸作为前体，它只能从饮食中获得。因此，这些结果表明，从糖酵解到FA代谢的代谢重编程发生在化生进展为发育异常期间，并产生一种独特形式的MUFA（FFA 20:1）。

图2: 空间和定量代谢谱揭示了致癌过程中代谢物的不同模式。（A）使用GCK胃的MALDI-IMS方法示意图，通过绘制从每个点收集的m/z强度，获得每个离子的质谱图像。（B）热图显示了未治疗（Unt）、幽门化生（PM）、不完全肠化生和HGD阶段单个代谢物的平均像素强度的相对值，彩色框表示与未治疗的胃相比，总离子计数的相对像素强度值。ARA，花生四烯酸；HA，二十二碳六烯酸；PA，磷脂酸；PI，磷脂酰肌醇。（C）己糖二磷酸强度的叠加。（D）GCK胃中磷酸己糖和二磷酸己糖的离子图像（左；用于IMS的组织切片相对应的H&E染色）。（E）棕榈酸酯或（F）MUFA（FFA 20:1）强度的叠加。（G）FA去饱和和延伸示意图。（H）GCK胃中长链脂肪酸的离子图像，单个代谢物的丰度归一化为100%。

3、发育异常细胞存活需要硬脂酰辅酶a去饱和酶（SCD）改变脂肪酸的不饱和度

该研究观察到发育异常腺体中关键代谢物的浓度和分布发生了变化，因此使用GCK小鼠癌变各阶段建立的胃类器官检查了糖酵解或FA代谢中重要代谢酶的表达水平（图3A）。与幽门化生、LGD或HGD类器官相比，与糖酵解相关的基因在In-IM类器官中高度表达。相反，与FA去饱和相关的基因（包括SCD1）的表达在LGD和HGD类器官中增加（图3B）。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是一种产生MUFAs的抑制酶。SCD1蛋白在LGD和HGD的过渡细胞区显著表达，通常在细胞增殖标志物Ki-67合成的细胞中(图3C和D)。

接下来，针对表达SCD1的发育不良类器官代谢途径的关键步骤(图3E)。该研究用靶向糖酵解或FA代谢的小分子抑制剂治疗发育不良的类器官3天。抑制糖酵解不影响类器官的活力或生长，但2-脱氧葡萄糖(2-DG)抑制了糖酵解的第一步(图3F和G)。

图3: SCD1在GCK胃中的特异性表达。(A)与相关酶相关的中枢代谢途径的关键步骤示意图。腺苷5′-三磷酸柠檬酸裂解酶;FADS, FA去饱和酶;FASN:脂肪酸合成酶;GLS1谷氨酰胺酶;乳酸脱氢酶;MPC，线粒体丙酮酸载体;PDH，丙酮酸脱氢酶;TCA，三羧酸循环。(B)热图显示了来自GCK胃的5个独立实验的胃类器官系中编码代谢酶或转运蛋白的基因的相对信使RNA水平。色框表示在幽门化生阶段归一化为Rplp0的基因的相对表达水平。(C和D) GCK胃SCD1(绿色)和Ki-67(红色)或CD44v9(红色)的免疫荧光(IF)染色。白色虚线框表示扩大的区域。白色虚线标识压盖形状。所有IF数据均为每组3只小鼠的代表性图像，并用Hoechst进行核染色。（E）正常或发育异常类器官中的SCD1染色（绿色）。（F）用二甲基亚砜（DMSO载体）、GSK2837808A（LDH抑制剂）、6-氨基烟酰胺（6-AN，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶【G6PD】抑制剂）、telaglenastat（GL S1抑制剂）持续3天。（G）用糖酵解代谢酶抑制剂处理3天的发育异常类器官中类器官直径的定量。（H）用二甲基亚砜（DMSO）、BMS303141（ACLY抑制剂）、C75（FASN抑制剂）、A939572（SCD抑制剂）或SC-26196（FA去饱和酶【FADS2】抑制剂）持续3天。（I）用脂代谢酶抑制剂处理3天的发育异常类器官中类器官直径的定量（n=50）。（J）DMSO或A939572处理1天的发育不良类器官中Ki-67(红色)和SCD1(绿色)的IF染色。

用A939572（SCD抑制剂）处理的类器官显示，在中央管腔中积累了裂解的caspase-3阳性凋亡细胞，细胞增殖减少(图4C)。然而，正常的胃类器官对A939572治疗没有表现出任何显著的变化(图4D-F)。此外，SCD抑制特异性针对体内发育不良细胞。我们在多西环素诱导6周后用A939572治疗GCK小鼠2周，观察到胃粘膜发生了显著变化(图4G)。

用载药处理的GCK小鼠显示化生进展为含有SPEM和过渡细胞区以及IM细胞的LGD。相比之下，A939572处理的GCK小鼠的H&E染色显示腺体过渡区和表面有许多死亡细胞。死亡或死亡细胞TFF3和TROP2均为阴性。在过渡区很少发现SCD1阳性细胞，这些细胞处于腺体挤出过程中。虽然每个腺体的ki -67阳性细胞总数没有变化，但在腺体腔中存在许多ki -67阳性细胞，并且这些ki -67阳性细胞的细胞核被压缩或碎片化，与增殖细胞的早期凋亡变化一致。通过裂解caspase-3和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸镍端标记(TUNEL)证实细胞死亡(图4H-K，箭头)。然而，SPEM细胞仍然存在于腺体基部，不与TUNEL信号合成(图4J)。因此，这些结果表明，SCD依赖性FA去饱和是发育不良细胞增殖和存活所必需的。

图4: SCD1在体内和体外调节发育异常细胞的增殖和存活。 (A和D)类器官经二甲基亚砜(DMSO)处理后的相衬图像。(B和E)类器官直径的定量(来自3个独立实验的50个类器官)。(C和F)用DMSO或A939572处理的类器官中裂解caspase-3 (CC-3，绿色)或细胞增殖(Ki-67，红色)的H&E染色或免疫荧光(IF)染色3个生物重复。(G) DMSO(载药)或A939572 处理的GCK小鼠胃H&E染色。箭头表示死亡细胞。(H) DMSO(载药)或A939572处理GCK小鼠胃中CC-3(绿色)的IF染色。箭头表示cc -3阳性细胞。(I) 每20 x视野图像中cc -3阳性细胞的定量。

(J)在对照或A939572处理的GCK胃中，末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸镍端标记(TUNEL，绿色)的IF染色。箭头表示tunel阳性细胞。(K) tunel阳性细胞每20 X图像区域。I和K中的每个点表示每20个细胞中cc -3阳性或tunel阳性细胞。

4、硬脂酰辅酶A去饱和酶依赖的脂肪酸去饱和产生不饱和长链脂肪酸，为发育不良细胞提供能量

该研究选择了2种代谢物，EA (20:1, n-9, MUFA)和DA (22:4, n-6, PUFA)(图5A)，用A939572联合EA或DA治疗发育不良类器官3天。A939572和EA共处理的类器官从SCD抑制中恢复，保留了类器官生长和球状结构。相比之下，A939572和DA共处理的类器官与仅A939572处理的类器官没有任何差异(图5B-D)。此外，当SCD1基因沉默时，发育异常的类器官没有生长和形成类器官球体，但补充EA仍可重建表型（图5E）。

为了确定EA在发育异常细胞中的亚细胞定位，研究将EA与硝基苯并噁二唑（NBD），一种绿色荧光化合物（NBD-EA）结合（图5F）。在处理后6小时，在发育异常细胞的二维单层培养中未检测到NBD-EA，但荧光信号在24小时时在线粒体中强烈积累，并微弱地维持到48小时（图5G）。

由于EA被输入到线粒体中，进一步研究EA是否经历FA氧化，FA氧化通过线粒体有氧代谢发生，并为三氯乙酸循环产生能量底物。肉碱棕榈酰转移酶（CPT）将长链脂肪酸转移到线粒体中，Cpt1a（CPT1的一种亚型）的表达在发育异常的类器官中上调（图5H）。

用A939572、EA和线粒体FA氧化抑制剂perhexiline共同处理的类器官没有显示出类器官生长的任何显著增加（图5I–K），这表明FA氧化的抑制消除了EA对发育异常类器官的拯救作用。因此，这些数据表明发育异常细胞使用EA作为线粒体中产生能量的主要底物。

图5: EA被用作FA氧化的关键能量底物。 (A) EA (20:1, n-9)或DA (22:4, n-6)的FA伸长率和去饱和示意图。(B) A939572联合EA或DA处理3天的发育不良类器官的相对比、h&e染色图像和(C)类器官直径定量(来自3个独立实验的50个类器官)。(D) A939572联合EA或DA处理3天的发育不良类器官细胞染色。(E)在治疗后第0天或第6天，SCD1 -siRNA或对照sirn单独或联合EA治疗的发育不良类器官的相衬图像。(F)合成的NBD共轭EA的化学结构(20:1,n-9)。(G) NBD或NBD- EA培养后6、24和48小时的发育不良细胞单层共聚焦图像。(H)胃类器官细胞系Cpt1a和Cpt2基因的相对信使RNA (mRNA)表达水平(n / 3个独立实验)。(I)过己胺在FA氧化中的靶分子示意图。(J)共处理后发育不良类器官的相对比图像和(K) 来自3个独立实验的20-35个类器官的直径定量。

5、在胃肠癌的癌前病变中观察到代谢重组模式

胃肠道其他器官的上皮细胞也经历了癌变的顺序过程。因此，研究SCD上调作为SCD依赖性FA去饱和度在人类胃肠道癌前阶段向癌症发展过程中的一个指标，对多组胃肠道患者组织微阵列以及癌前病变和胃癌、食道、胰腺癌组成的切片进行了SCD免疫染色(图6)。

在胃癌组织中，与配对的正常组相比，在IM和发育不良病变中，无论是LGD还是HGD, SCD的表达都显著增加(图6A)。此外，SCD主要在CD44v9-/TROP2+发育不良细胞中表达，但在CD44v9+/TROP2+过渡细胞中也有表达，表明SCD在化生和发育不良之间的过渡区域显著增加(图6B)。SCD在肠型胃癌中高表达，与弥漫性胃癌相比，肠型胃癌是在一个致癌级联中发展的(图6A和C)。在胰腺癌中，3种主要类型，包括粘液囊性瘤变、导管内乳头状粘液瘤变和胰腺上皮内瘤变，被定义为癌前病变。与正常或LGD病变相比，所有3种癌前病变和腺癌的HGD中SCD表达均升高(图6D和E)。

最后，食管腺癌由癌前化生(Barrett上皮)和异型增生发展而来。与配对的正常组织相比，食管Barrett上皮、异型增生和腺癌中SCD的表达显著增加（图6F和G）。因此，这些结果表明SCD上调是在胃肠道癌前化生进展为发育异常期间观察到的常见特征。

为了评估SCD依赖性FA去饱和是否对人类发育不良细胞的存活是必要的，该研究用A939572处理了9个人类胃类器官系，这些系来源于化生或发育不良的患者样本，其中23个来源于A939572。类器官对SCD抑制表现出广泛的敏感性(图6H-K)。同时表达SCD和TROP2、的发育异常类器官系在治疗后6天内没有生长并死亡(图6H -J和L)。然而，表达SCD较弱且TROP2阴性的类器官对治疗没有反应(图6H、K、L)。这些结果共同表明，SCD功能对发育异常细胞的存活很重要，在癌前化生的致癌过渡过程中，SCD依赖性FA去饱和可能被激活。

图6: SCD在人类胃肠道癌发生中的上调。（A）在邻近的正常、肠化、LGD、HGD和肠型或弥漫型胃癌（GC）组织中对人SCD进行免疫组织化学（IHC）染色。（B）人类胃组织中SCD（绿色）、TROP2（红色）和CD44v9（蓝色）的H&E和共免疫染色的代表性图像。人类胃组织中SCD的IHC H-评分。（D）IHC染色检测癌旁正常组织、腺泡-导管化生组织、粘液囊性瘤、导管内乳头状粘液瘤、胰腺上皮内瘤和胰腺导管腺癌中的SCD。（E）人类胰腺组织中SCD的IHC H-评分。（F）对邻近正常食管、巴雷特食管、异型增生和食管腺癌中的SCD进行IHC染色。（H）用二甲基亚砜（DMSO）或A939572治疗后6天的人类癌前类器官（hPCOs）直径的定量。用DMSO或A939572（1 mmol/L）处理的hPCOs的（I–K）相差和H&E染色图像。对A939572治疗的（I）高反应，（J）中度或（K）低反应。（L）hPCOs中SCD（绿色）和TROP2（红色）以及Ki-67（蓝色）的免疫荧光染色。

文章总结：

1.通过多西环素处理的GCK小鼠，诱导Kras基因在主细胞中的活性表达，同时对GCK小鼠的胃部进行组织学切片检查，免疫荧光染色。结果表明在4个月内GCK小鼠发展出癌前病变和高级别异型增生。

2.使用MALDI成像质谱技术，揭示了从上皮化生进展到异型增生过程中，代谢重编程从糖酵解转向脂肪酸代谢。

3.小鼠和人胃类器官的培养与代谢酶抑制剂处理：通过脂肪酸脱饱和酶（SCD）改变脂肪酸的不饱和度，产生一种新的二十碳烯酸，为异型增生细胞的过度增殖和存活提供能量。

4.免疫组化染色结果表明，在人类胃肠道癌症中，SCD在癌变过程中表达上调，表明SCD抑制剂能够杀死小鼠和人类异型增生的类器官，并且在体内选择性靶向异型增生细胞。

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