质粒的提取实验报告

柱式质粒提取试剂盒

产品简介：

采用优化的 SDS-碱裂解法裂解细胞，高效去除抑制物等杂质，离心吸附柱内的硅基质膜在

高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，并最大限度的去除蛋白质、基因

组 DNA、RNA 和其他杂质，最后在低盐、高 pH 的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质

膜上洗脱，每个吸附柱可吸附高达 50μg 的质粒 DNA。纯化的质粒 DNA 可直接用于酶切、

PCR、测序、转化、转染一些常规的传代细胞等生物学实验。

产品内容：

储存条件：

RNase A，-30 ~ -15℃保存，干冰运输；

其他组分 15 ~ 25℃保存，室温运输。

使用步骤：

1、取 5-15 mL 过夜培养菌液加入离心管中，12000 rpm 离心 1 min 收集菌体沉淀，尽量吸弃

上清。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 500 μL Buffer P1（已加入 RNase A），使用移液枪或涡

旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀，混匀至无菌块。

3、向离心管中加入 500 μL Buffer P2，温和上下颠倒混匀 4-6 次，充分混匀使菌体裂解，此

时溶液应变得清亮粘稠。

注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA。所用时间不应超过 5 min，以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入 700 μL Buffer P3，立即温和上下颠倒混匀 8-10 次，充分混匀，此时应出现白色絮状沉淀，12000 rpm 离心 10 min。

注意：P3 加入后立即混合，避免产生局部沉淀。如果离心完仍有沉淀漂浮，可延长离心时间取上清。

5、将步骤 4 中的上清液分批转移到已装入收集管的吸附柱中，12000 rpm 离心 1 min，倒掉

收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：一根吸附柱最大容积为 750 uL，请分两次转移上清液到吸附柱中。

6、向吸附柱中加入 500 μL Buffer PD，12000 rpm 离心 1 min，弃废液。

7、向吸附柱中加入 600 μL Buffer PW（使用前请确认是否加入无水乙醇），12000 rpm 离心

1 min，弃废液。

注意：加入漂洗液 PW 后，室温静置 2-5 min，有助于更好的去除杂质。

8、重复一次步骤 7。

9、将吸附柱重新放回收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液。

注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，确保乙醇挥发干净。

10、将吸附柱放到一个干净灭菌 1.5 mL 离心管中，将吸附柱开盖静置数分钟。向吸附膜中

间位置悬空滴加 50-100 µL Buffer TE 或 ddH2O（可提前放在 55 - 65 ℃水浴锅中预热，提高

质粒 DNA 回收率），室温放置 2 min。12,000 rpm ，离心 2 min 收集质粒 DNA 溶液（若需

要获得最高产量，建议将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复第 10 步进行二次洗脱。）。

11、质粒溶液保存在- 20℃。

注意事项：

1、使用前请短暂离心 RNase A，将试剂盒提供的 RNase A 溶液全部加入 Buffer P1 中，置于

4℃保存。

2、首次使用前按 Buffer PW 瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇稀释 Buffer PW，于室温保

存。

3、若低温保存时，Buffer P2、Buffer P3 和 Buffer PD 溶液容易产生白色沉淀，使用前可室

温放置一段时间，必要时可在 37℃水浴锅中预热至沉淀完全溶解，混匀后再使用。

4、Buffer PD 可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为 endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、

JM 系列）等核酸酶含量较高的菌株时，必须使用 Buffer PD。

5、处理低拷贝质粒时，提高菌液的用量，并按比例扩大 Buffer P1、Buffer P2 和 Buffer P3

的用量。

6、使用 Buffer P2、Buffer P3 和 Buffer PD 应戴手套，使用后应立即盖紧盖子。

7、自备试剂：乙醇。

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刘蒋芳4278提取的质粒DNA的质量与产量与哪些因素有关?为什么要用对数期的菌液提取质粒? -
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