质粒转化后不长菌落
通盼软2751转化后的菌液怎样接种到平板上比较好我们在做转化时,涂班时老是长成团没单个菌落,画线时又长不起来 -
鲜空净19382007395 ______[答案] 你应该是有基础的,所以我回答就简要的说一下,转化纯质粒转化吧?转化的时候,摇40分钟,涂板的时候少吸点,不要离心,100要是还不单,就50,实在还是长得比较糊就摇完之后少吸点之后再加新的LB稀释,再吸点涂,总之就是要稀一点,我...
通盼软2751为什么挑的单克隆在LB培养基中培养了快12个小时,菌液还是那么少,浓度不够,不能测序 -
鲜空净19382007395 ______ 可能挑的单克隆活性不高,也有可能是没挑到. 我觉得更像是前一种可能. 你可以从一下几个方面思考: 1 是否菌液中抗生素浓度加的过高? 2 是否培养时间不够? (因为我们培养常常要超过20个小时,在高浓度抗生素平板上长出菌不容易啊!) 3 是否导入质粒失败? 也可能跟你转化的质粒有关.有些质粒转化后转化子是长的很慢的,如BT340,需30度培养2天才能长出直径1mm左右的转化子. 我觉得可以适当提高平板培养时的温度,我一般都是37度培养,12-16个小时就长出来了,如果超过24小时,就有可能长没有转化的菌落了. 另外有一点需要注意的就是有可能因为抗生素浓度施加过高导致菌体增殖受阻.
通盼软2751质粒转化农杆菌感受态后,挑斑摇菌菌液PCR后无条带.我是加了质粒相应的抗生素的,能长斑不久说明转进去了吗,为什么没条带呢? -
鲜空净19382007395 ______[答案] 质粒转化应该比较容易,要检查一下引物对不对.其次是你的模板够不够,因为农杆菌中质粒拷贝数很低.可以提出质粒后再来PCR
通盼软2751关于质粒转化
鲜空净19382007395 ______ 1.电击转化时通过瞬时高压使细胞表面出现微小的孔洞,从而使外源DNA能通过孔洞进入到细胞里面,一般适用于革兰氏阳性细菌或者真核微生物; 热激转化是使用钙盐或者镁盐溶液在低温状态下处理细胞使其处于感受态状态,然后通过短时热激使其吸入外源DNA片段,主要应用于革兰氏阴性细菌. 这些我想你应该懂的.我就不赘述了. 2.大肠杆菌作为革兰氏阴性细菌,使用一般的化学转化即热激转化就可以了,为何要劳神费力使用电转化?转化的目的不就是简单而方便为原则么?正所谓杀鸡焉用牛刀? 希望我的回答对你有帮助.
通盼软2751电击转化实验中,为什么未加质粒的抗性板子会长出菌落 -
鲜空净19382007395 ______ 较大可能性是抗性失效或者抗性添加量太少,导致转化后长的菌大多是没有转进质粒的菌.建议把抗生素验证一下.
通盼软2751【求助】菌落PCR有目的条带与菌液PCR却什么都没有? -
鲜空净19382007395 ______[答案] 高手们好.最近做酶切连接转化,最后做鉴定时,以菌落为模板进行PCR时可以见到有目的条带;当把菌落接种到LB液扩菌后,以菌液为模板进行PCR时却什么东东都没有?请问会是什么原因啊?多多指教啊!建议重新以菌落为模板进行PCR检测,...
通盼软2751我做在引物中引入SacII酶切位点,PCR后SacII酶切回收后做连接,但是不长菌,这是怎么回事?
鲜空净19382007395 ______ 我想你做的是一个质粒的环形反向PCR,然后酶切、自连,形成一个新的质粒吧.LA Taq并不是一个好的选择,你应当选用保真度更高的酶,以保证在PCR后,你想要的碱基都还是原来的样子.即使这样,突变也是难免的,需要测序验证. 没有克隆的原因有以下几种:1、设计不合理,设计时自连的新质粒上大肠杆菌复制子,或者抗性基因丢失或者被破坏.2、酶切不完全,使其粘端不匹配,包括保护碱基过少,酶切体系中酶量或DNA量加的过大.3、操作时有小片段缺失,特别是粘端,因为是单链,丢失后,也无法匹配形成连接产物,所以操作时要轻柔.4、连接酶失效了.
通盼软2751...的培养基上.质粒中抗氨苄青霉素基因称为___,在筛选过程起作用.若要证明培养基是否符合实验要求,培养基上需接种___的感受态大肠杆菌,培养后不出... -
鲜空净19382007395 ______[答案] (1)图表示用BamHI为限制性内切酶,能识别特定的碱基序列,切割含目的基因的DNA片段,质粒经相同限制酶处理后,形成的黏性末端相同,经DNA连接酶酶的作用获得基因表达载体,也叫重组质粒.由于质粒中含有标记基因抗氨苄青霉素基因,故...
通盼软2751有现成的质粒,无原始的菌种或菌液,如何对质粒进行扩增? -
鲜空净19382007395 ______ 我用的感受态细菌DH5α,将质粒转入感受态中,涂到培养基上,在长出细菌后挑克隆到培养液中摇,再抽出来送去测序就好了,具体详细步骤有点麻烦
通盼软2751【求助】菌落PCR有目的条带与菌液PCR却什么都没有? -
鲜空净19382007395 ______ 高手们好.最近做酶切连接转化,最后做鉴定时,以菌落为模板进行PCR时可以见到有目的条带;当把菌落接种到LB液扩菌后,以菌液为模板进行PCR时却什么东东都没有?请问会是什么原因啊?多多指教啊!建议重新以菌落为模板进行PCR...