质粒载体双酶切电泳分析

阮枝章2985做重组质粒双酶切验证,酶切后跑电泳结果条带很模糊是什么原因? -
荣尤珠18433561595 ______ 可能酶过量或者加的质粒体积大带进去杂质产生星号活性.

阮枝章2985载体是否双酶切完全 -
荣尤珠18433561595 ______ 原载体质粒回收后电泳可能出现三条带 环状质粒、复制中间体、开环的质粒.复制中间体的大小接近质粒的两倍,开环的质粒跑的比环状的要快,在质粒的上方.不知你说的是哪两条; 双酶切看你的酶切位点设在哪里,理论上应该切下两个片段,如果两个片段大小上差距不大则电泳时很难分开,就是一条带了,如果切下的小片段很小,在电泳图上也很难显示;一般质粒双酶切不会出现这两种情况,所以我认为如果切开了应该是两条比较亮的带,上面的那条应该比下面的那条稍亮. 总之,应该设置没有切开的质粒做对照,做个比较就知道了; 希望对你有用

阮枝章2985对于载体的单酶切和双酶切,胶图分别会如何?为什么会这样啊? -
荣尤珠18433561595 ______[答案] 单酶切一个电泳道上会有几个比较亮的带,而且你所根据基因大小所选择的条带内也不一定是你要的.原因是单酶切形成的粘性末端完全相同,就像拼图,除了内容不同,两边完全切合.所以结合方式过多,可能性也多,如质粒和目的基...

阮枝章2985提完质粒后需要做什么工作?是跑琼脂糖电泳还是做PCR检测?PCR检测和酶切检测各指的什么? -
荣尤珠18433561595 ______[答案] 一般先跑琼脂糖电泳检测是否提出了高质量的质粒,然后通过PCR检测所提的质粒是否是目的质粒. PCR检测指用特异引物对目的DNA进行PCR,根据产物判断 DNA是否含有目标序列.酶切检测则是通过对目的DNA上已知酶切位点的酶切,根据产物...

阮枝章2985酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事? -
荣尤珠18433561595 ______ 建议你做如下改进: 1. 原始质粒上样2ul,电泳检测,确定质粒质量没问题; 2. 所有酶切体系均改为10ul,其中质粒2ul,酶0.1ul (双酶切时另一种酶也加0.1ul ),buffer终浓度为 1*,剩下为去离子水.酶切时间为4小时左右. 3.电泳用的凝胶最好为新鲜配制的,浓度视质粒大小而定,一般为1%; 电泳的缓冲液最好也是新鲜配制的,电泳电压适当. 1KB的条带拖尾严重,可能是凝胶不新鲜,或者是电泳时电压过高,或者是酶切时间过长.上述建议中已经给出解决方法. 至于你说的奇怪现象,可能质粒已经降解,也可能是酶切过久导致降解,也可能是枪头或者离心管等器材污染,总之保证一切是新鲜的,再做一次.

阮枝章2985对PFGC1008载体进行双酶切,分别为ASCI和BAMHI,然后进行电泳切胶回收,但是发现酶切时为三条带? -
荣尤珠18433561595 ______ 可能是酶切效率比较低造成的,质粒完全没有被切开时为1条带,部分被切开时有3条带.需查验一下所使用的试剂和酶切条件参数是否有问题.

阮枝章2985双酶切质粒后电泳 的问题 -
荣尤珠18433561595 ______ 很显然是质粒发生了自连啦.切开的2个质粒连起来了,因此相当于2个质粒的大小.你需采用磷酸化避免自连发生.

阮枝章2985筛选阳性克隆的方法和原理?我需要至少两种方法和原理,两种. -
荣尤珠18433561595 ______[答案] 最常见的就是蓝白斑筛选,详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm 方法很多,除蓝白斑筛选外,像 菌落PCR验证:详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm 从细菌里提取质粒后双酶切验证:用构建重组质粒时的两种限制...

阮枝章2985刚活化后 提取的质粒(小量试剂盒提取法) 电泳图为什么会出现2、3条带?这是中间载体的质粒,马上要酶切 之后链接,之前是因为没有链接成功,所以怀... -
荣尤珠18433561595 ______[答案] 这是很正常的,质粒提取过程中或多或少会对质粒本身造成一定的损伤,根据损伤的不同,质粒通常会出现三种不同的构型,分别是双链环状,线性分子(机械损伤造成质粒链完全断开)和单链开环(双链中只有一条链断开,另外一条是闭合的)....

阮枝章2985质粒跑电泳 -
荣尤珠18433561595 ______ 这个可能性很多啊.最大的可能是你的酶污染了其他酶.还有这种问题你要是觉得其他两条带大小正确,就不要太纠结了,往后做吧.如果非得找原因的话,再重复几次,酶用量,酶切时间之类的多考虑点.