载体双酶切后条带大小不对

徒凝态5066对PFGC1008载体进行双酶切,分别为ASCI和BAMHI,然后进行电泳切胶回收,但是发现酶切时为三条带? -
伏轰奔15835656884 ______ 可能是酶切效率比较低造成的,质粒完全没有被切开时为1条带,部分被切开时有3条带.需查验一下所使用的试剂和酶切条件参数是否有问题.

徒凝态5066PCR产物和质粒双酶切后电泳如何判断酶切完成? -
伏轰奔15835656884 ______ 你是不是要把双酶切后的质粒与载体连接,而无论是PCR还是载体都无法通过电泳判断是否酶切完全,所以不好进行连接呀?对于PCR产物一般会采取这样的策略,将产物首先连接到T载体上,然后再用设计好的双酶切,电泳回收切下的条带,这样就能确保得到的是完全酶切的产物.载体判断比较麻烦,要看载体本身、多大双酶切为点之间的条带有多大、双切前后的大小是否能通过电泳区别出来,但是双切位点一般都在标记基因里面,所以插入片段的载体会在后期转化可以后区分开,所以也没有太大必要确定他是否完全,只要充分酶切就好了.

徒凝态5066电泳区分相差200bp的条带,一个是2680bp,一个是2871bp -
伏轰奔15835656884 ______ 酶切完了跑电泳不就可以了? 1.2左右的琼脂糖凝胶可以分开. 或者两个都胶回收一下,然后P一下呗.

徒凝态5066重组质粒双酶切鉴定 -
伏轰奔15835656884 ______ 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了. 你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题. pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常. 换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.

徒凝态5066载体酶切切不出条带是怎么回事? -
伏轰奔15835656884 ______ 1.是酶切单口还是酶切双口?酶切单口没条带2.酶切的两个酶切位点距离是多大?几个bp的话是看不出条带的,且很难切,需要加长酶切时间;几十个bp的话,跑太快了,电泳时间一长,就跑出...

徒凝态5066载体是否双酶切完全 -
伏轰奔15835656884 ______ 原载体质粒回收后电泳可能出现三条带 环状质粒、复制中间体、开环的质粒.复制中间体的大小接近质粒的两倍,开环的质粒跑的比环状的要快,在质粒的上方.不知你说的是哪两条; 双酶切看你的酶切位点设在哪里,理论上应该切下两个片段,如果两个片段大小上差距不大则电泳时很难分开,就是一条带了,如果切下的小片段很小,在电泳图上也很难显示;一般质粒双酶切不会出现这两种情况,所以我认为如果切开了应该是两条比较亮的带,上面的那条应该比下面的那条稍亮. 总之,应该设置没有切开的质粒做对照,做个比较就知道了; 希望对你有用

徒凝态5066pcr扩增出的片断正确但双酶切结果却偏大,不只是为什么?请高手指点?我的酶切底物是构建好的质粒载体.原来还酶切的正确但自从转菌之后再提取质粒... -
伏轰奔15835656884 ______[答案] 可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.

徒凝态5066请大家帮我看看我的双酶切连接转化过程哪儿出错了 -
伏轰奔15835656884 ______ pcr没有问题.而且双酶切一般不会出现片段自连的情况.所以那个条带不是目的片段的自连,而是超螺旋的质粒.要鉴定片段是否插入了载体,最好用双酶切进行鉴定.若是...

徒凝态5066单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,... -
伏轰奔15835656884 ______[答案] 首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近. 建议:首先电...

徒凝态5066对于载体的单酶切和双酶切,胶图分别会如何?为什么会这样啊? -
伏轰奔15835656884 ______[答案] 单酶切一个电泳道上会有几个比较亮的带,而且你所根据基因大小所选择的条带内也不一定是你要的.原因是单酶切形成的粘性末端完全相同,就像拼图,除了内容不同,两边完全切合.所以结合方式过多,可能性也多,如质粒和目的基...