酵母双杂交系统过程图

小分子靶点鉴定技术∣巧用亲和层析技术鉴定非共价结合蛋白

导语：

翻译后修饰及蛋白互作一直是生命科学领域研究的重点，但由于其过程的复杂性，研究人员在研究过程中经常遇到各种难题，对于非共价结合的低亲和蛋白更是难以入手研究。在此，和大家分享一篇发表在Analytica Chimica Acta（IF:6.2）上的文献，题目是“Photo-affinity pulling down of low-affinity binding proteins mediated by post-translational modifications”，文中作者研发了一种新的光亲和磁珠，通过在光亲和磁珠上引入PEG钝化层减少非特异性相互作用，且这种光亲和磁珠可以将PTM介导的非共价相互作用转变为共价相互作用，确保低亲和蛋白被检测到，作者利用这种方法鉴定了一组可以与Flap内切酶1 (FEN1)蛋白上特定甲基化位点相互作用的蛋白质。

摘要：

由翻译后修饰(PTMs)介导的蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)在生物系统中起着关键作用。然而，研究PTM介导的PPIs的技术挑战阻碍了许多研究进展。在这项工作中，作者开发了一种光亲和下拉试验方法来下拉低亲和结合蛋白，从而筛选PTM介导的PPIs。该方法通过光激活键将PTM介导的非共价相互作用转化为共价相互作用，从而冻结低亲和结合相互作用。制备的光亲和磁珠(PAMBs)确保了捕获相互作用蛋白的高特异性和高分辨率。此外，与传统的下拉法相比，在PAMB上引入PEG钝化层显著减少了非特异性相互作用。为了验证概念，通过使用这种新开发的分析方法，作者已经确定了一组可以与Flap内切酶1 (FEN1)蛋白上特定甲基化位点相互作用的蛋白质。与传统的生物亲和素下拉系统相比，干扰蛋白更少(减少80%以上)，蛋白质亚类更多。因此，这种新的下拉方法可能为低亲和力PPIs的研究提供有用的工具，并有助于发现生物医学研究中根本需要的PTM介导的新相互作用的潜在靶点。

研究背景：

蛋白-蛋白相互作用(PPIs)在分子水平上介导许多生物过程中的生化活动，探索细胞过程的分子机制的主要方法是使用诱饵蛋白来找出通路中的证据链。因此，识别PPIs的技术在生物学研究中变得势在必行。目前，PPI检测技术包括下拉法、免疫共沉淀法(Co-IP)、串联亲和纯化质谱法(TAP-MS)、蛋白片段互补法、酵母双杂交系统法、单分子检测法、生物信息学分析法等。

翻译后修饰(Post-translational modification, PTMs)被称为蛋白质亚分子水平的化学修饰，是调控PPIs的主要机制。PTMs介导的PPIs越来越多地被证实在细胞的动态生物化学中发挥着核心作用，如癌症的发展、细胞命运的决定、细胞信号整合等。因此，筛选PTM位点并解码相应的信息在生物学研究中是非常必要的。目前，尽管许多技术可以在蛋白质上发现新的PTM位点，但鉴定PTM相互作用的蛋白质仍然具有挑战性，因为蛋白质上的亚分子修饰通常以低丰度存在，并且它们也动态地介导低亲和力相互作用。现有的方法不能满足PTM介导的PPI测定的要求。

光亲和连接技术是鉴定PTMs相互作用蛋白的理想技术，通过光激活将亲和相互作用转化为共价连接。在这项工作中，通过将光亲和连接技术整合到下拉系统中，以及制造光亲和磁珠(PAMBs)，作者新提出了一种用于鉴定PTM位点上PTM介导的PPIs的通用检测方法。

技术路线：

实验结果：

光亲和磁珠（PAMBs）的制备与表征

蛋白上的PTMs通过调控PPIs在细胞过程中发挥重要作用，但PTMs在重组蛋白中难以复制，因此采用PTM修饰肽制备PAMBs。在磁珠表面，引入聚乙二醇钝化层以避免蛋白质的非特异性吸附。然后，将合成的具有位点特异性PTM修饰的肽探针连接在一起。在附着的肽探针上，两个活性基团在n端被修饰，即半胱氨酸侧链上的巯基(C)和光反应位点(重氮嘧啶)在赖氨酸(K)的ε-NH2上被修饰。巯基可以通过形成二硫键与PEG层连接，重氮嘧啶为PTM相互作用蛋白的共价键提供光反应位点。这两组共同作用，以促进PAMB在系统中的功能。在制备过程中，精氨酸(Rme2a)上的甲基化位点被修饰为PTM位点，如图1a和b所示。由于这些修饰可以影响PAMB的表面电荷，因此通过ζ电位分析表征了PAMB的逐步制备。如图1c和d所示，具有n -羟基琥珀酰亚胺(NHS)官能团的珠子显示出4.34 mV的电位。经PEG钝化层修饰后，电位显著变化至22.5 mV，可能是由于PEG上巯基修饰所致。MB-PEG-P1和MB-PEG-P2阳性肽的进一步附着使电位分别逆转到28.4 mV和28.3 mV。作者注意到MB-PEG-P1和MB-PEG-P2之间有轻微的ζ电位变化，这可能是由肽探针上的Rme2a修饰引起的。

作者通过荧光标记肽探针进一步证实了肽探针在微球上的附着。使用氨基反应性荧光团(6-FAM SE)。用6-FAM SE孵育后，可以荧光观察到肽功能化的MB(图2)，而未修饰肽的MB几乎无法荧光观察到。实验结果表明，所制备的多肽探针可以很好地修饰在磁珠上。

蛋白下拉实验条件的优化

接着作者对制备的PAMB进行了工艺优化，包括更改不同浓度的多肽以提高连接效率，摸索多个样本浓度以确定最佳实验浓度为2.0 mg/mL，修饰PAMB结构来进一步提高蛋白质负载能力。

减少非特异性吸附

磁珠的包被和表面化学是至关重要的，因为它决定了靶蛋白的结合特异性和效率。以往的研究表明，非特异性吸附会污染磁珠的表面。文中作者通过在珠子上涂上PEG钝化层减少污染，对捕获的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析表明，与磁珠和亲和素修饰的磁珠相比，增加PEG钝化层可以分别减少相互作用蛋白总量的51.3%和26.7%(图3a和b)。结果表明，聚乙二醇层有助于减少非特异性吸附，从而有助于提高下拉试验的特异性。为了进一步测试诱饵探针对微球污染的影响，作者用含有该肽序列的全长蛋白代替了该肽。当使用全长蛋白探针时，观察到吸附蛋白的数量增加了一倍，如图3c和d所示。

PTM相互作用蛋白的光亲和下拉

鉴定PTM介导的PPIs对生物学研究具有重要意义。这里，为了验证概念，作者修改了PAMB上Flap Endonuclease 1蛋白(FEN1)的尾肽作为肽探针，其PTMs可能调节FEN1在DNA复制和基因组稳定性中的关键功能。为了测试该试验的可行性，使用针对PTM位点(Rme2a)的抗体作为模型蛋白。如图4a所示，作者首先将PAMB与一抗孵育，光亲和下拉反应后，PAMB与指示抗体(FITC标记的IgG)孵育。图4b分别为无模型蛋白(一抗)和含模型蛋白(一抗)PAMB的显微镜图，只有与模型蛋白孵育的PAMBs能被荧光观察到。

为了进行实际样品分析，作者将PAMB与细胞裂解液孵育，图5a的PAGE分析显示了Rme2a修饰肽(P2)与非PTM肽(P1)之间相互作用图谱的变化。对比传统的生物素-亲和素下拉系统作为平行方法，以测试新开发的光亲和系统的性能。图5b中的凝胶分析和蛋白质定量分析显示，捕获的蛋白质数量明显减少，P1为81.7%，P2为80.7%，这表明光亲和法的非特异性相互作用减少。然后，作者通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析对捕获的蛋白质进行鉴定。值得注意的是，根据蛋白质功能确定丰度，约60%的低丰度蛋白质可以被钓出，远高于生物素-亲和素系统中的16%。结果表明，该系统受样品中高表达蛋白的干扰较小。图5c的结果表明，该蛋白可以被有效捕获。此外，光亲和下拉系统显示，与生物素-亲和素系统相比，这种相互作用是特异性的，图5d中的交叉区域以粉红色表示，表明所开发的系统对PTM介导的PPI具有很高的特异性。

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