酶切失败的原因有哪些

蓟逸皇4836再次请教生物问题 -
赫波力17562691711 ______ 一般,防止酶切产物自连最常用的就是双酶切,因为产生的粘性末端不同,所以很难发生自连.但实际上最后筛选的时候经常也会出现空载体的情况,这个很大一部分原因是有部分载体没有切动,并不是载体自连的问题.这些没有切动的载体转化率是非常高的,这是转化过程中假阳性的最大来源.载体自连最容易发生的情况有两种,一种是单酶切,一种是平末端连接.这两种情况下,通常为了防止载体自连会对酶切后的载体使用碱性磷酸酶处理,将DNA 5'端的-P基团置换成-OH,这样会一定程度的防止载体自连.

蓟逸皇4836如何判断酶有否切开位点,什么因素可能导致酶切不开.如何解决 -
赫波力17562691711 ______ 高温.PH 值太小或太大.

蓟逸皇4836关于分子生物学实验中酶切的问题 -
赫波力17562691711 ______ 原因可能有很多啊,不过4个小时应该能看到条带了,也可能切下来的太少电泳看不到,也可能没切下来.你可以用这两个酶分别作单酶切跑电泳,那质粒做对照看看是否两个酶都能酶切成功.

蓟逸皇4836PCR失败的原因及如何改善 -
赫波力17562691711 ______[答案] PCR反应的五要素 1、引物 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,... 应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败. ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有...

蓟逸皇4836我做连接,用SwaⅠ酶切,平头末端,用T4连接酶25度反应一小时,总是不成功,能给分析一下原因或有好的方法 -
赫波力17562691711 ______ 平头连接本来就没有粘性末端连接容易,一般我们永T4连接的话是16度过夜,成功率很高.也可4度冰箱放久点.说明书说25度也是可以的,我们一直没有试过.如果前面的实验都正确的,建议采用16度水浴过夜

蓟逸皇4836质粒双酶切 -
赫波力17562691711 ______ 双酶切不成功 怎么知道质粒大小正确? 菌落PCR只能说明你PCR的目的片段在载体上 不能说明这个载体没问题 双酶切不成功要不就是酶有问题 如果排除酶的问题 可能是你的载体突变了 最好有原始的质粒 换一批感受态重新转染抽质粒

蓟逸皇4836做重组质粒时,转化提质粒后PCR验证为阳性,但是酶切却切不出来! -
赫波力17562691711 ______ pcr验证时常呈假阳性,以酶切验证为准.或者你可以送去测序.

蓟逸皇4836如果质粒dna双酶切电泳后,在胶上出现1)没有条带2)一条3)两条4)三条5)多条,都是什么原因? -
赫波力17562691711 ______[答案] 1) 质粒上没有这两种酶的酶切位点(或操作失误,试验失败) 2)质粒上只有一种酶的酶切位点或两个酶的位点非常接近(

蓟逸皇4836tev酶切目的蛋白除去his标签但是无反应的原因 -
赫波力17562691711 ______ 所谓的无反应是指什么? 是指酶切反应没有发生吗?就是切前和切后没有变化? 如果是这样的话,先看下酶切的缓冲液是否合适,一般最好是使用pH7.0左右的缓冲体系.比如20mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,1mM DTT,pH7.0 酶切温度在30度左右 如果目的蛋白有二硫键形成的二聚体,为了确保不破坏二硫键,可以用1mM GSH 加1mM GSSG来代替DTT.

蓟逸皇4836最近在做PCR - RFLP,本来是两个条带的,却切成了三个条带,是不是酶切不完全造成的啊?怎么解决啊? -
赫波力17562691711 ______ 你好,首先你要确认这个里面确实没有发生酶切位点的变化(同你的与其相比).另外,最下面往往有一条杂带,那个是干扰的,可以不用看.如果这些问题都不是,那基本上酶切不完全造成的,可以延长酶切时间或者摸索更好的酶切条件.