链球菌革兰氏染色描述

细菌性微生物是我国导致食源性疾病发生的主要病因，据统计每年我国食源性致病菌导致数千万人次发病，严重危及人们的健康，由此造成的损失巨大，成为目前较为突出的公共卫生问题之一。其中主要食源性致病菌包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、和蜡样芽胞杆菌等，尤其是蜡样芽孢杆菌引发的食物中毒问题越来越受到人们的关注。

“炒饭综合征”，即蜡样芽孢杆菌引起的食源性疾病，具有明显的季节性，多发生在6月到10月；被蜡样芽孢杆菌污染的食品，外观一般无明显变化，看不到腐败变质现象，因此难以通过肉眼辨别是否受蜡样芽孢杆菌污染。污染的食品常因为食前保存温度不当(26～37℃)，放置时间较长，或加工不当等原因使食品中污染的蜡样芽孢杆菌得以生长繁殖。少量摄入蜡样芽孢杆菌不会引起食物中毒，只有其在食物中成指数生长才会产生肠毒素。一般认为蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒属毒素型食物中毒。

NO.01 蜡样芽胞杆菌简介

蜡样芽胞杆菌，是一种条件致病菌，通常可在室温下长时间放置的炒饭或米饭中发现，由其引起的病症通常成为“炒饭综合征”。该菌生长的最适温度为28℃～37℃，其繁殖体较耐热，需100℃×20分钟才被杀死，其芽胞可耐受100℃×30分钟或干热120℃×60分钟才能被杀死，这也是它不同于其他食源性致病菌的重要特征。

蜡样芽胞杆菌广泛存在于自然界中，通常生活在土壤、灰尘和水体中。易污染该菌的食品为米制品、乳制品、腐乳、泡菜、熟肉及熟菜、调料、蛋羹、汤类及生的蔬菜等。被蜡样芽胞杆菌污染的食品，外观一般无明显变化，除米饭有时稍有发馊、口味不爽外，大多数食品感观性状正常，不易发现腐败变质迹象。因此难以通过肉眼辨别是否受蜡样芽胞杆菌污染。夏季气温更接近于蜡样芽胞杆菌的最适生长温度，因此该季节是炒饭综合征的高峰期。

NO.02 蜡样芽胞杆菌食物中毒情况及原因

蜡样芽胞杆菌食物中毒是由食物中的大量活菌和该菌产生的毒素引起，该菌食物中毒发病率较高，一般为60%～100%，预后良好，无死亡。中毒的症状有两种类型：一种是腹泻型，由蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素引起，肠毒素不耐热，在45℃×30分钟或56℃×5分钟的情况下，毒素会被破坏失去毒性，此类型食物中毒较少。另一种是呕吐型，由蜡样芽胞杆菌产生的催吐毒素引起，该类食物中毒比腹泻型更严重。催吐毒素在加热126℃×90分钟的情况下，毒素都不会被破坏，含有毒素的食品即使高温加热仍可以引起人类中毒，因此国内报道的该菌食物中毒多为此型。引起呕吐型食物中毒的主要食品是米饭及其制品（80%以上），凉面、豆腐也可以引发。

NO.03 蜡样芽胞杆菌的检验标准及限量要求

我国现行《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607-2021）规定第一类（制作过程中，所有组分均经彻底加热处理，存储后销售的散装即食食品）和第二类（制作过程中，加入了未彻底加热处理组分或生鲜组分，经或未经存储后销售的散装即食食品）中以米为主要原料制作的食品中蜡样芽胞杆菌不得超过10000 CFU/g（mL）。香港《即食食品微生物含量索引》和澳门《即食食物的微生物含量判定指引》均规定一般即食食品中蜡样芽胞杆菌不得超过100000 CFU/g，同时满意范围为小于1000 CFU/g。 

国际上，澳大利亚和新西兰的即食食品微生物限量标准，规定蜡样芽胞杆菌和其他致病性芽胞杆菌不得超过10000 CFU/g，同时满意范围为小于100 CFU/g。英国即食食品微生物限量要求蜡样芽胞杆菌和其他致病性芽胞杆菌不得超过100000 CFU/g，满意范围为小于1000 CFU/g。韩国规定即食食品和新鲜的即食食品中蜡样芽胞杆菌和其他致病性芽胞杆菌不得超过1000 CFU/g。

我国现行检验标准为GB 4789.14-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》

NO.04 蜡样芽胞杆菌检验

一 蜡样芽胞杆菌检验原理

蜡样芽胞杆菌的检验原理为根据其在特定培养基上特定的生长、形态和生理生化特征，首先将样品中的微生物细胞均匀分散在稀释液中，再将稀释液涂布在MYP琼脂平板上30℃培养24小时后，挑取典型菌落在营养琼脂上纯培养；随后进行染色镜检、生化鉴定、动力试验、溶血试验、根状生长试验、溶菌酶耐性试验、蛋白质毒素结晶试验等确证试验；最后根据计数和确证试验的结果计算蜡样芽胞杆菌的数量。

二 蜡样芽胞杆菌平板法

2、操作步骤

2.1 样品处理：冷冻样品应在45℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-10℃~-20℃保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存，24 h内检验。

2.2 样品制备：称取样品25 g，放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为1:10的样品匀液。

2.3 样品的稀释：吸取2.2中1:10的样品匀液1 mL加到装有9mL PBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1:100的样品匀液。跟据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

2.4 样品接种：根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3mL、0.3 mL、0.4 mL接种量分别移入三块MYP琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

2.5 分离、培养

2.5.1 分离：在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30℃±1℃培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30℃±1℃培养24 h±2 h。如果菌落不典型，可继续培养24 h±2 h再观察。在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇)，周围有白色至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）。

MYP琼脂平板

2.5.2 纯培养：从每个平板中挑取至少5个典型菌落（小于5个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24 h±2 h，进行确证实验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm～10 mm。

2.6 确定鉴定

2.6.1 染色镜检：挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌，大小为（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm），芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。

2.6.2 生化鉴定

2.6.2.1 生化特征：本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。具体见表1。

2.6.2.2 动力试验：用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30℃培养24h。有动力的蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。也可用悬滴法检查。

2.6.2.3 溶血试验：挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB琼脂平板上，30℃±1℃培养24 h±2 h。蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽胞杆菌为不溶血。

2.6.2.4 根状生长试验：挑取单个可疑菌落按间隔2cm～3cm左右距离划平行直线于经室温干燥1d～2d的营养琼脂平板上，30℃±1℃培养24h～48h，不能超过72h。用蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌标准株作为对照进行同步试验。蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。

2.6.2.5 溶菌酶耐性试验：用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，36℃±1℃培养24 h。蜡样芽胞杆菌在本培养基（含0.001%溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24 h。巨大芽胞杆菌不生长。

2.6.2.6 蛋白质毒素结晶试验：挑取纯培养的单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上，30℃±1℃培养24 h±2 h，并于室温放置3 d～4 d，挑取培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满0.5%碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min～2 min，移去火焰，再更换染色液再次加温染色30 s，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富，应再将培养物置室温2 d～3 d后进行检查。除苏云金芽胞杆菌外，其他芽胞杆菌不产生蛋白结晶体。

3. 结果计算：

3.1 典型菌落计数和确认

选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果出现a）~f）现象按4.4.2.1中公式（1）计算：
      a）只有一个稀释度的平板菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；
      b）2个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU之间，但只有一个稀释度的平板有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
      c）所有稀释度的平板菌落数均小于20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；
      d）某一稀释度的平板菌落数大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
      e）所有稀释度的平板菌落数均大于200 CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；
      f）所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU时，应计数最接近20 CFU或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。

如果出现g）现象则按4.4.2.2中公式（2）计算：
      g)2个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU之间且均有典型菌落。

4 结果与报告：

4.1 根据MYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按3.1中公式（1）、公式（2）计算，报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌菌数，以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

4.2 必要时报告蜡样芽胞杆菌生化分型结果。

三 蜡样芽胞杆菌MPN法

操作步骤：

样品处理、样品制备、样品的稀释同平板法操作；

样品接种：取3个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），接种于10 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉汤中，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL（如果接种量需要超过1 mL，则用双料胰酪胨大豆多黏菌素肉汤）。于30℃±1℃培养48 h±2 h。

培养：用接种环从各管中分别移取1环，划线接种到MYP琼脂平板上，30℃±1℃培养24 h±2 h。如果菌落不典型，可继续培养24 h±2 h再观察。

确定鉴定：从每个平板选取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24 h±2 h，进行确证实验，同平板法。

结果与报告：根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数，查MPN检索表（见附录B），报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。

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