12%聚丙烯酰胺凝胶配方
1.5 mol/L Tris (PH8.8)
1.称量181.7gTris置于1L烧杯中。
2.加入约800 ml去离子水,充分搅拌溶解。
3.用浓盐酸调节pH值至8.8。
4.定容至1L.
5.高压灭菌后,室温保存。
注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1oC,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
(参照kara公司Catalog-N1)
1 mol/L Tris (PH6.8)
1.称量121.1gTris置于1L烧杯中。
2.加入约800 ml去离子水,充分搅拌溶解。
3.按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值 | 浓HCl |
6.8 | |
7.4 | 约70 ml |
7.6 | 约60 ml |
8.0 | 约42 ml |
4.定容至1L.
5.高压灭菌后,室温保存。
注意:1.溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1oC,溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色,应予丢弃,并置备质量更好的Tris。
(参照kara公司Catalog-N1)
30%丙稀酰胺(100ml)
1.称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺(Acrylamide) | 29 g |
双丙烯酰胺 (BIS) | 1 g |
2.加入约60 ml去离子水,充分搅拌溶解。
3.定容至100 ml,用0.45 µm滤膜滤去杂质。
5.于棕色瓶中4 oC保存。
注意:1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成分。
(参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)
30%SDS
1.称量10 g高纯度(电泳级)的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2.加入约800 ml去离子水,68oC加热溶解。
3.滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。
4.定容至100 ml,室温保存。
(参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)
10%过硫酸铵
1.称量1 g过硫酸铵。
2.加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。
3.储存于4oC。
注意:10%过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右,超过期限会失去催化作用。
(参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)
1×SDS凝胶加样缓冲液
50 mmol/L | Tris·Cl (pH 6.8) |
100 mmol/L | DTT |
2% | SDS (电泳级) |
0.1% | 溴酚蓝 |
10% | 甘油 |
不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。
(参照《分子克隆》二版P884)
本人将参照此配方,配成5×或6×,各成分浓度均扩大5倍。
另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS-PAGE Loading Buffer配方:
组分浓度:
250 mmol/L | Tris·Cl (pH 6.8) |
10% (W/V) | SDS (电泳级) |
0.5% (W/V) | 溴酚蓝(BPB) |
50% (V/V) | 甘油 |
5% (W/V) | β-巯基乙醇(2-ME) |
配制量5 ml
配制方法
1.称量下列试剂置于10ml塑料离心管中。
1 M Tris·Cl (pH 6.8) | 1.25 ml |
SDS (电泳级) | 0.5 g |
溴酚蓝(BPB) | 25 mg |
甘油 | 2.5 ml |
2.加去离子水溶解后定容至5 ml。
3.小份(500 ul/份)分装后于室温保存。
4.使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
1 mol/L DTT(20 ml)
1.称取3.09 gDTT,加入到50 ml塑料离心管中。
2.加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2),溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。水配
3.分装后-20oC保存。
(参照《分子克隆》二版P884)
3 M醋酸钠(NaOAc)(100 ml)
1.称取40.8 gNaOAc·3H2O置于100~200ml烧杯中,加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
2.加冰醋酸调节pH值至5.2。
3.定容至100 ml,高压灭菌后室温保存。
(参照《分子克隆》二版P884)
0.01 MNaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。
5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)
组分浓度:0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS
1.称量下列试剂置于烧杯中。
Tris | 15.1 g |
Glycine | 94 g |
10%(W/V) SDS(电泳级) | 50 ml 或5g SDS |
2.加入约900 ml去离子水搅拌溶解。
3.定容至1L,室温保存。
(参照《分子克隆》二版P884)
Transfer Buffer:
[自配]Transfer Buffer:500ml
25mMTris base, 0.2M glycine(甘氨酸), 20% methanol(甲醇PH8.5)
先配制1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至100ml,调PH8.5(1L约加22ml浓盐酸)
1M12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol + ddH2O 至400ml,调好PH值,再加ddH2O至500ml.
先置于4oC保存备用。
(参照吴兴军给Protoco,据说优于《分子克隆》配方)
丽春红S储存液(10×)
丽春红S | 2 g |
三氯乙酸 | 30 g |
磺基水杨酸 | 30 g |
加水至100 ml。 |
用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液,使用后应予废弃。
10X TBS (Tris-buffered saline):
To prepare 1 liter of 10X TBS:24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).
(参照Cell signal Technology Protoco)
Wash Buffer TBS/T:(0.05%吐温)可用PBST代替
1X TBS, 0.1% Tween-20
[自配] Wash Buffer TBS/T:1000ml
1×TBS,0.1%Tween-20,100ml 10×TBS+ 1ml Tween-20+ 900ml ddH2O
(参照Cell signal Technology Protoco)
Blocking Buffer:(3%BSA的TBST或PBST)封闭
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。
[自配]Blocking buffer:150ml
for 150ml, add 15ml 10×TBS to 135 ml water,mix.Add7.5g nonfat milk and mix well.While strirring,add 0.15ml Tween-20(100%).
(现用现配,4oC储存备用)
(参照Cell signal Technology Protoco)
Primary Antibody Dilution Buffer:抗体稀释(1%BSA TBST或PBST,不加BSA也可)
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% blocking agent;
for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add1.0 g BSA and mix well. While stirring, add 20 µl Tween-20 (100%).
(参照Cell signal Technology Protoco)
显色液(好用)
5mg DAB;200ul 1M Tris(PH=8.5,常用作纯化液母液);9.5ml水,静置5min(加入Tris缓冲液会变浑浊),加入3.5ul 双氧水,现用现配,可配好无双氧水的10X母液分装,-20℃保存,1ml/支,用时稀释到10ml并加入3.5ul双氧水即可使用。
本实验室SDS-PAGE电泳凝胶配方如下:
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祖章子15638678071 ______ 关键是配胶,分离胶和浓缩胶的配制很重要,如果没有封好底分离胶不凝,你实验就没法做了,别外你血清蛋白的稀释也很重要,不然杂蛋白太多了也无法看到,如果能做个盐析什么的就更好了,这样的蛋白干净,能去除很多非血清蛋白.
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孙泽爸2128在做聚丙烯酰胺凝胶电泳时为什么分离胶可以凝固,但浓缩胶很长时间都凝固不了 -
祖章子15638678071 ______ 主要可能是TEMED和AP的量的问题,你可以参考一下我的配方: 分离胶12.5%(SDS),10ml体系 分离缓冲:2.5ml 贮胶:4.167ml 纯水:3.233ml 10%SDS:0.1ml 10%AP:100微升 TEMED:5微升 ———————————————————————— 浓缩胶5%,4ml体系 浓缩缓冲:1ml 贮胶:0.6ml 纯水:2.35ml 10%AP:45微升 TEMED:15微升 ———————————————————————— 以上配方经本人亲用无数次证明切实有效,大概在一小时左右即可凝固,天冷凝得慢可放置于25度烘箱内帮助加速凝固.
孙泽爸2128聚丙烯酰胺凝胶 -
祖章子15638678071 ______ 主要还是看微生物的种类吧.我觉得凝胶中含有多种有机物比如Acr、Tris、SDS、这些都有可能成为微生物的碳源与氮源吧?而且如果把胶置于空气中,空气中的灰尘颗粒中也是含有多种不明成分的,所以具体是哪一种就怕不好说.个人意见,仅供参考.
孙泽爸2128变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法有哪些呢?
祖章子15638678071 ______ 采用回流灌注法灌注凝胶.因制备好的胶室有弹簧夹,将胶室放置在一水平支架上.一人操作时以靠近操作者一侧胶室底角为最低点,左手托住对侧玻璃板中部抬高胶室约30°.右手从低侧短玻璃处缓缓灌注胶液成连续的细流,到达底部后逐步放低胶室,直至灌满,水平放置后插入梳子,6%凝胶聚合常需1~2小时.灌胶中如有气泡形成,调整胶室角度消除气泡后稍放缓灌胶速度常能凑效.