12%聚丙烯酰胺凝胶配方
1.5 mol/L Tris (PH8.8)
1．称量181.7gTris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）
1 mol/L Tris (PH6.8)
1．称量121.1gTris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值 | 浓HCl |
6.8 | |
7.4 | 约70 ml |
7.6 | 约60 ml |
8.0 | 约42 ml |
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）
30％丙稀酰胺（100ml）
1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） | 29 g |
双丙烯酰胺 (BIS) | 1 g |
2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml,用0.45 µm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
30％SDS
1．称量10 g高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。
4．定容至100 ml，室温保存。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
10％过硫酸铵
1．称量1 g过硫酸铵。
2．加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。
3．储存于4oC。
注意：10％过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。
（参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
1×SDS凝胶加样缓冲液
50 mmol/L | Tris·Cl (pH 6.8) |
100 mmol/L | DTT |
2% | SDS （电泳级） |
0.1% | 溴酚蓝 |
10% | 甘油 |
不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。
（参照《分子克隆》二版P884）
本人将参照此配方，配成5×或6×，各成分浓度均扩大5倍。
另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS－PAGE Loading Buffer配方：
组分浓度：
250 mmol/L | Tris·Cl (pH 6.8) |
10% (W/V) | SDS （电泳级） |
0.5% (W/V) | 溴酚蓝（BPB） |
50% (V/V) | 甘油 |
5% (W/V) | β-巯基乙醇（2-ME） |
配制量5 ml
配制方法
1．称量下列试剂置于10ml塑料离心管中。
1 M Tris·Cl (pH 6.8) | 1.25 ml |
SDS （电泳级） | 0.5 g |
溴酚蓝（BPB） | 25 mg |
甘油 | 2.5 ml |
2．加去离子水溶解后定容至5 ml。
3．小份（500 ul/份）分装后于室温保存。
4．使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
5．加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
1 mol/L DTT(20 ml)
1．称取3.09 gDTT，加入到50 ml塑料离心管中。
2．加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。水配
3．分装后－20oC保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
3 M醋酸钠（NaOAc）（100 ml）
1．称取40.8 gNaOAc·3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
2．加冰醋酸调节pH值至5.2。
3．定容至100 ml，高压灭菌后室温保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
0.01 MNaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。
5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）
组分浓度：0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS
1．称量下列试剂置于烧杯中。
Tris | 15.1 g |
Glycine | 94 g |
10%(W/V) SDS（电泳级） | 50 ml 或5g SDS |
2．加入约900 ml去离子水搅拌溶解。
3．定容至1L，室温保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
Transfer Buffer:
[自配]Transfer Buffer:500ml
25mMTris base, 0.2M glycine（甘氨酸）, 20% methanol(甲醇PH8.5)
先配制1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至100ml,调PH8.5（1L约加22ml浓盐酸）
1M12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol + ddH2O 至400ml,调好PH值，再加ddH2O至500ml.
先置于4oC保存备用。
（参照吴兴军给Protoco,据说优于《分子克隆》配方）
丽春红S储存液（10×）
丽春红S | 2 g |
三氯乙酸 | 30 g |
磺基水杨酸 | 30 g |
加水至100 ml。 |
用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液，使用后应予废弃。
10X TBS (Tris-buffered saline):
To prepare 1 liter of 10X TBS:24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).
（参照Cell signal Technology Protoco）
Wash Buffer TBS/T:（0.05%吐温）可用PBST代替
1X TBS, 0.1% Tween-20
[自配] Wash Buffer TBS/T:1000ml
1×TBS,0.1%Tween-20,100ml 10×TBS+ 1ml Tween-20+ 900ml ddH2O
（参照Cell signal Technology Protoco）
Blocking Buffer:（3%BSA的TBST或PBST）封闭
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。
[自配]Blocking buffer:150ml
for 150ml, add 15ml 10×TBS to 135 ml water,mix.Add7.5g nonfat milk and mix well.While strirring,add 0.15ml Tween-20(100%).
(现用现配，4oC储存备用)
（参照Cell signal Technology Protoco）
Primary Antibody Dilution Buffer:抗体稀释（1%BSA TBST或PBST，不加BSA也可）
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% blocking agent;
for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add1.0 g BSA and mix well. While stirring, add 20 µl Tween-20 (100%).
（参照Cell signal Technology Protoco）
显色液（好用）
5mg DAB；200ul 1M Tris（PH=8.5，常用作纯化液母液）；9.5ml水，静置5min（加入Tris缓冲液会变浑浊），加入3.5ul 双氧水，现用现配，可配好无双氧水的10X母液分装，-20℃保存，1ml/支，用时稀释到10ml并加入3.5ul双氧水即可使用。
本实验室SDS-PAGE电泳凝胶配方如下：
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孙泽爸2128凝胶酶谱的SDS聚丙烯酰胺凝胶和western中的配制方法有什么区别? -
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祖章子15638678071 ______ 2. 拿一小烧杯,按下表加入各试剂: (12%分离胶)
孙泽爸2128如何制备聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的步骤 -
祖章子15638678071 ______ 在网上你搜你所需要的相应的配方,比如说你需要跑的是DNA,则依据DNA的片段长短选取不同比例的ARC-BIS,然后配制,这些百度都有的,分子生物学课本上也有.配好之后直接灌胶即可.如果你跑的蛋白,则需要配浓缩胶和分离胶
孙泽爸2128有没有谁知道对SOD酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时浓缩胶的配方? -
祖章子15638678071 ______ 以总体积为8ml的5%的浓缩胶为例,水:5.5ml30%丙烯酰胺溶液:1.3ml1.5mol/LTris(pH8.8):1.0ml10%SDS:80ul10%过硫酸氨:80ul TEMED:6ul 胶不凝或凝得慢,增加过硫酸铵的量到100ul或增加TEMED的量到10ul,不会影响电泳效果.
孙泽爸2128做好聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白的关键步骤是什么?为什么? -
祖章子15638678071 ______ 关键是配胶,分离胶和浓缩胶的配制很重要,如果没有封好底分离胶不凝,你实验就没法做了,别外你血清蛋白的稀释也很重要,不然杂蛋白太多了也无法看到,如果能做个盐析什么的就更好了,这样的蛋白干净,能去除很多非血清蛋白.
孙泽爸2128聚丙烯酰胺凝胶怎样能溶解 -
祖章子15638678071 ______ 用高温应该可以..
孙泽爸2128在做聚丙烯酰胺凝胶电泳时为什么分离胶可以凝固,但浓缩胶很长时间都凝固不了 -
祖章子15638678071 ______ 主要可能是TEMED和AP的量的问题,你可以参考一下我的配方: 分离胶12.5%(SDS),10ml体系 分离缓冲:2.5ml 贮胶:4.167ml 纯水:3.233ml 10%SDS:0.1ml 10%AP:100微升 TEMED:5微升 ———————————————————————— 浓缩胶5%,4ml体系 浓缩缓冲:1ml 贮胶:0.6ml 纯水:2.35ml 10%AP:45微升 TEMED:15微升 ———————————————————————— 以上配方经本人亲用无数次证明切实有效,大概在一小时左右即可凝固,天冷凝得慢可放置于25度烘箱内帮助加速凝固.
孙泽爸2128聚丙烯酰胺凝胶 -
祖章子15638678071 ______ 主要还是看微生物的种类吧.我觉得凝胶中含有多种有机物比如Acr、Tris、SDS、这些都有可能成为微生物的碳源与氮源吧?而且如果把胶置于空气中,空气中的灰尘颗粒中也是含有多种不明成分的,所以具体是哪一种就怕不好说.个人意见,仅供参考.
孙泽爸2128变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法有哪些呢?
祖章子15638678071 ______ 采用回流灌注法灌注凝胶.因制备好的胶室有弹簧夹,将胶室放置在一水平支架上.一人操作时以靠近操作者一侧胶室底角为最低点,左手托住对侧玻璃板中部抬高胶室约30°.右手从低侧短玻璃处缓缓灌注胶液成连续的细流,到达底部后逐步放低胶室,直至灌满,水平放置后插入梳子,6%凝胶聚合常需1~2小时.灌胶中如有气泡形成,调整胶室角度消除气泡后稍放缓灌胶速度常能凑效.