il-6与炎症

2024年2月，加州大学洛杉矶分校研究团队在《美国国家科学院院刊》上发表了一篇研究，提出了冠状病毒在体内被灭活分解后，其裂解碎片仍可通过模仿体内一些特定的免疫分子作用来诱发炎症。这种免疫反应的过度激活被称为细胞因子风暴，是没必要且有害的，会损害健康组织和器官，也解释了重症新冠病例中观察到的肺外多器官并发，以及普遍存在的自体免疫过激的临床表现。其研究证据表明，来自 SARS-CoV-2 的病毒多肽片段可以与 dsRNA "重新组装 "成一种促炎性纳米结晶凝聚物，从而导致协同多价免疫识别和被严重放大的炎症反应。

关键结论

1. SARS-CoV-2 病毒的蛋白分解是宿主清除病毒的一个重要节点，但高病毒载量会产生残余病毒肽片段，这些残余病毒成分具有促炎能力。对SARS-CoV-2蛋白质组的计算机分析揭示了模仿宿主抗菌肽（xynoAMPs）的序列基序，尤其是能增强炎症反应的高阳离子人类抗菌肽 LL-37。

2. SARS-CoV-2能将双链 RNA（dsRNA）组装成纳米结晶复合物，其晶格常数与 Toll 样受体（TLR）-3 的立体尺寸相称。这种复合物能放大培养物中各种未感染细胞类型（上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、单核细胞和巨噬细胞）的细胞因子分泌。

3. 中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）可加工新冠病毒片段形成异源抗菌肽（AMPs）。除了对宿主组织的直接损伤外，COVID-19 重症患者体内 NE 和 MMP-9 的表达上调也会导致促炎性异源AMPs 的增加。

4. 最近的研究表明蛋白酶活性可在其他情况下导致严重炎症。适当应用蛋白酶抑制剂来抑制异源AMP 的形成，可能会减轻严重SARS-CoV-2 所致的炎症。

关于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染如何导致强烈但无益的炎症反应，目前还不清楚。这种炎症反应是 2019 年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的特征，在不同类型的细胞中放大了免疫激活过程，包括不含感染所需的ACE2 受体的细胞。SARS-CoV-2 病毒的蛋白分解是宿主清除病毒的一个重要节点，但高病毒载量会产生残余病毒肽片段，影响尚不清楚。在这里，我们从感染宿主环境中超分子自组织的角度研究了残余病毒成分的促炎能力。有趣的是，对SARS-CoV-2蛋白质组的计算机分析揭示了模仿宿主抗菌肽（xynoAMPs）的序列基序，尤其是能增强炎症反应的高阳离子人类抗菌肽 LL-37。与低致病性冠状病毒相比，SARS-CoV-2 强烈富集了这类异源AMPs。此外，SARS-CoV-2 而非低致病性同源物中的异源AMPs 能将双链 RNA（dsRNA）组装成纳米结晶复合物，其晶格常数与 Toll 样受体（TLR）-3 的立体尺寸相称，因此能进行多价结合。这种复合物能放大培养物中各种未感染细胞类型（上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、单核细胞和巨噬细胞）的细胞因子分泌，类似于类风湿性关节炎和红斑狼疮中白介素的作用。尽管使用了小于 0.3% 的病毒蛋白质组，但诱导的转录组与 COVID-19 中的全局基因表达模式非常吻合。将这些复合物输入未感染的小鼠体内可提高血浆IL-6和CXCL1的水平，这在COVID-19患者身上也能观察到。

经过 COVID-19 大流行期间的深入研究，现在已经对 SARS-CoV-2 感染有了一定的了解。然而，冠状病毒之所以成为新型冠状病毒，并能引起危害如此严重的炎症反应，目前对该机制的了解仍不全面。此前对冠状病毒的基因组分析提供了一些线索，该分析发现致死率高的冠状病毒蛋白质组往往含有更多的阳离子氨基酸，但目前还不清楚静电作用的改变是如何形成 COVID-19 特有的结果的。最近的研究表明，来自先天性免疫系统的阳离子两亲肽可与阴离子核酸发生淀粉样组装，形成高度促炎的复合物。在这个研究中，我们采用了一种特殊的方法，将冠状病毒的蛋白质组视为一个肽片段库，当病毒被蛋白水解破坏时，这些肽片段就会被释放出来，并作出以下可能性分析：1）这些片段可以模仿宿主先天性免疫肽，并与阴离子 dsRNA（病毒感染中常见的配体，可被先天性免疫系统识别）组装在一起；2）由此组装成的超分子复合物是否可能与 COVID-19 的多种病理生理学有关。

COVID-19 在未免疫宿主中的病理生理学确实是多种多样的，而且尚不明确：大多数确诊的 SARS-CoV-2 病例（81%）病情较轻，但高达 5%的病例会出现呼吸衰竭、脓毒性休克和/或多系统器官衰竭。严重的肺部炎症伴随血清中的促炎细胞因子升高[尤其是IL-6、IL-8 和TNF-α和支气管肺泡灌洗液中的促炎细胞因子升高（尤其是 CXCL1、CXCL2 和 CXCL6），导致中性粒细胞浸润和肺部活化，符合急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发展。皮肤炎症表现为 "COVID 手指/脚趾"。令人困惑的是，COVID-19 的影响会散播到多个未被 SARS-CoV-2 直接感染的器官和组织。例如，严重的凝血病变似乎与内皮功能障碍而非病毒直接感染有关。另一方面的问题集中在一些 COVID-19 患者出现临床关节炎样综合征和红斑狼疮样综合征，其特点是高自身抗体浓度和免疫细胞活化模式，常见于类风湿性关节炎和红斑狼疮。要从根本上了解 COVID-19 的病理生理学，就必须同时了解这些严重的病理现象以及临床严重程度的异质性。尽管要证明这些不同病理现象背后的具体分子机制需要进行多项大规模的人体研究，因此超出了目前工作的范围，但我们在这项研究中证明，SARS-CoV-2 的蛋白质组具有很强的产生肽片段的能力，这些肽片段可导致上述看似不同的临床结果，而相对无害的 "普通感冒 "病毒的同源肽则不太可能产生这样的结果。

在该研究中，我们考虑这样一种可能，即免疫系统对病毒的蛋白分解并不一定是 COVID-19 中宿主清除病毒的终点（正如食物的酶分解并不是食物对我们新陈代谢影响的终点一样）。我们使用计算机学习分类器来帮助识别 SARS-CoV-2 蛋白体组中的免疫拟态肽序列，这些序列再现了阳离子抗菌肽（AMPs）的功能，阳离子抗菌肽是一类关键的效应分子，可以驱动先天性免疫反应，而先天性免疫反应失调可导致红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。AMPs 最早是因其抗菌和透膜活性而被发现的，但一些高阳离子 AMPs（如 抗菌肽 LL-37）已被证明在红斑狼疮和类风湿性关节炎以及自身免疫性皮肤病（如银屑病和红斑痤疮）中具有强效促炎作用。对于人类 LL-37（以及具有与曼宁极限相当的高阳离子电荷密度的 AMPs）来说，这种免疫放大能力可追溯到它们通过反离子释放的熵增结合阴离子核酸并将其组织成有序复合物的能力。这些复合物的形成还能保护核酸成分不被酶降解，从而提高它们在宿主体内的持久性并增强其自身免疫效应。在这里，我们发现免疫拟态阳离子 SARS-CoV-2 "xenoAMPs" 可以与阴离子聚（I：C）（一种 dsRNA 合成类似物）结合成液晶复合物，其晶格常数与 dsRNA 受体 TLR3（类 Toll 受体-3）的立体尺寸相称，这就通过超选择性的变化增强了多价的静电合作结合和免疫激活的放大作用，超选择性最初是针对纳米颗粒中的多价相互作用而设计的。加上超分子复合物的 "免疫检查 "产生的同源效应，原则上可以引起严重失衡的免疫反应，尤其是考虑到严重感染的宿主体内存在大量病毒。与这一假设一致，我们发现异源AMP-聚（I:C）复合物能在多种健康的未感染细胞中引发强烈的细胞因子分泌，包括上皮细胞、内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞。被异源AMPs激活的原代内皮细胞的转录组与COVID-19感染的全基因表达谱非常吻合，尽管所用的肽片段只占病毒蛋白质组的不到0.3%。将这些复合物输送到小鼠体内可提高血浆中 IL-6 和 CXCL1 的水平，正如在感染 COVID-19 的人类身上观察到的一样。这些结果表明，COVID-19 导致的严重并发症（如细胞因子风暴、皮肤病变、凝血功能障碍）有一种独特的机制，并对非直接感染靶点的组织产生重大影响。

病毒 AMP 样片段对宿主细胞的影响取决于该类分子的类型和数量。因此，我们绘制并解析了 SARS-CoV-2 蛋白体组中的所有类 AMP 序列（xynoAMPs）。要确定 xenoAMPs 的全部范围和性质，需要考虑一系列问题。SARS-CoV-2 的 RNA 基因组异常庞大（约 30 千碱基，kb），编码约 30 种成熟蛋白质，这些蛋白质经过宿主和/或病毒蛋白酶的大量加工，产生重要的功能分子，使得该研究更加复杂。SARS-CoV-2 蛋白体组中是否存在强 AMP 样基序，数量有多少？鉴于受感染宿主体内的病毒数量庞大，研究是否在棘突蛋白等重复结构中发现了异种 AMP 尤为重要。这些肽基中编码的类 AMP 功能对不同蛋白酶在细微不同位置上的裂解敏感度如何？最后，如果分析低致病性的 "普通感冒 "冠状病毒，这些 AMP 样基序会发生怎样的变化？

为了回答这些问题，我们使用以前训练过的支持向量机（SVM）分类器来识别 SARS-CoV-2 蛋白中的类似 AMP 序列。该分类器已在多种系统中得到验证。首先，为了识别潜在的异源AMPs并评估它们在附近不同氨基酸位置被裂解后是否仍类似于AMPs，SARS-CoV-2蛋白序列通过一个24到34个氨基酸的移动窗口进行扫描，这是许多AMPs的典型大小。与传统的生物信息学工具相比，这种方法可以揭示与已知 AMP 序列相似度较低的 AMP 样序列，因此非常适合用于鉴定 SARS-CoV-2 中未预期的促炎异种 AMP 候选序列。分类器会输出一个σ分数（σ）来描述给定序列的 AMP 特性：强阳性和强阴性 σ 分值分别表示该序列是 AMP 或不是 AMP 的概率 P(+1)较高。(高于 0 的 σ 分值对应于 P(+1) > 0.5 的概率）。从这些高分 AMP 样序列中，我们选择了具有足够高阳离子电荷的特定序列，以模仿人类 抗菌肽 LL-37 将阴离子 dsRNA 组织成有序结构以进行免疫调节的能力，因为 dsRNA 是一种与病原体相关的分子模式，可能会从被 SARS-CoV-2 感染的受损细胞中释放出来。

虽然病毒片段在宿主个体中的位置分布会有所不同，但强异源AMP 序列的基本有效性依然基于病毒蛋白质组本身。我们重点研究了三个代表性蛋白（一个非结构蛋白，两个结构蛋白；选择标准 σ 分数 > 1.1, P (+1) > 0. 98）：来自 ORF1ab 多聚蛋白的 xenoAMP(ORF1ab)（1972 至 2004，σ 得分 = 2.46），来自棘突（S）蛋白的 xenoAMP(S)（529 至 558，σ 得分 = 1.52），来自膜（M）蛋白的 xenoAMP(M)（146 至 169，σ 得分 = 1.19）（图 1A）。与类似于 AMP 的行为相一致的是，使用径向扩散试验 (RDA) 观察到 xenoAMP 对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌株具有广谱抗菌活性，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 菌株 (LAC-USA300) 和铜绿假单胞菌 PA01（SI 附录，表 S1）。对 SARS-CoV-2 蛋白上的裂解位点进行的计算机分析表明，蛋白酶体降解过程中会产生异源AMPs。(SI 附录，图 S1）我们的研究结果表明，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）都能产生 xenoAMPs。我们注意到，这两种特异性蛋白酶的高表达水平与急性肺损伤和高炎症相关。

图 1. SARS-CoV-2 蛋白质中存在外源性的促炎症宿主抗菌肽模拟物（xenoAMPs）

我们直接比较了 SARS-CoV-2 与轻型普通感冒冠状病毒人类冠状病毒-OC43（HCoVOC43）的同源序列（图 1B）。高致病性人类冠状病毒（SARS-CoV-2 和 SARS-CoV）与温和的非流行性人类冠状病毒（HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV229E、 和 HCoV-NL63）显示序列部分保守，但致病性更强的冠状病毒，尤其是 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 的 σ 得分更高，能更好地模拟宿主阳离子 AMPs（SI 附录，图 S2）。S2). 比较 ORF1ab 多聚蛋白、S 蛋白和 M 蛋白的 SARS-CoV-2 与 HCoV-OC43 σ 得分热力图（图 1C）显示，高分序列一般聚集在不同位置的 "热点 "中，与 HCoV-OC43 相比，SARS-CoV-2 热点的得分更高，跨越的序列空间区域更广（热点的黄色多于蓝色，足迹更大）。这一分析表明，特异性 SARS-CoV-2 异源AMP 的 AMP 特性在不同程度的裂解过程中可能相当持久：SARS-CoV-2 蛋白序列中的阳离子氨基酸和疏水氨基酸的组织方式使 σ 得分保持在惊人的高水平，即使在不完美的裂解过程中，相对于高分示例异源AMP，序列被延长或缩短。(SI附录，表S2）这些证据共同表明，SARS-CoV-2中的热点可以产生更多得分更高的异源AMPs，而且与HCoVOC43中的异源AMPs相比，SARS-CoV-2中的异源AMPs更不容易因降解过程中的长度异质性而降低得分。此外，与 HCoV-OC43 相比，SARS-CoV-2 的传播性更高，复制速度更快，这使得 SARSCoV-2 中的异源AMPs 的可用性更大，这也进一步导致 COVID-19 在人类宿主中的异源AMPs 数量更多。

图 S2. 六种人类冠状病毒的序列比对

与 "普通感冒 "冠状病毒相比，我们注意到 SARSCoV-2 有更多高阳离子电荷和高计算分数的序列。这些序列是模仿宿主促炎 AMPs（如 LL-37）的最佳选择，LL-37 的线性电荷密度高达 ~+1.1e/nm。LL-37 的电荷密度接近曼宁极限，即每比约拉姆长度（0.7 nm）1 个电荷，这是线性大离子封存凝聚反离子的理想标准，因此能够与 dsRNA 发生强烈的熵驱动复合。由于阳离子电荷是 AMP 的基本特性，我们的研究结果与之前的全基因组分析结果一致，即在致死率较高的冠状病毒中存在正电荷积累。总之，SARS-CoV-2 的异源AMP 候选序列具有较高的计算σ 得分，并有很高的概率像 AMPs 一样发挥作用。此外，这些异源AMP候选序列具有较高的阳离子电荷，有利于促炎性dsRNA的组织。最后，与非流行性冠状病毒 HCoV-OC43 中的酶裂解位点相比，SARS-CoV-2 中更多的酶裂解位点原则上可以产生高分的 xenoAMP 候选物。最后一点非常重要，因为宿主体内存在多种蛋白酶，它们在不同的组织中具有不同的裂解位点。

阳离子 AMPs 极易与阴离子脂质和阴离子核酸紧密结合，因为这种结合与其电荷和已知的抗菌机制有关。因此，一般来说，在体内检测不到高浓度的游离 AMPs。尽管如此，我们还是对 29 例 COVID-19 重症患者的气管吸出物样本进行了质谱分析，以评估使用自下而上的蛋白质组学数据收集方案可以检测到哪些物质，该方案优先考虑无偏见的检测。预计重症 COVID-19 炎症引起的中性粒细胞增多会导致宿主 AMP LL-37 的释放。与这一预期相一致，我们在质谱测量的 29 份患者样本中的 20 份样本中发现了 LL-37 的片段。相比之下，我们在 29 份患者样本中的 28 份中发现了 SARS-CoV-2 肽片段，其中一些片段的 σ 分数很高，可以归类为 xenoAMPs。测量和分析的详情见 SI 附录图 S3。

图 S3. COVID-19 危重患者气管吸出物样本的质谱测量

 与基于计算机的分析结果一致，实验发现所有三种高得分、高阳离子电荷的异源AMPs都能将dsRNA有序地合成和组织成复合物，其方式与人抗菌肽 LL-37等AMPs表现出的方式相同，尽管这些异源AMPs表现出的有序结构不如典型的AMPs。LL-37 将核酸组装成纳米晶柱状晶格，核酸间距约为 3.3 至 4.0 nm，这使得多价核酸能呈递到紧密排列的 TLR3（dsRNA）和 TLR9（dsDNA），从而大幅提高免疫激活效果。为了模拟病毒复制过程中产生的病毒 dsRNA，以下实验使用了 poly(I:C) 作为合成类似物。在同步辐射小角 X 射线散射（SAXS）中，三种等电位 xenoAMP 聚（I:C）复合物的结构显示出相同的基本衍射特征：对于 xenoAMP(ORF1ab)-聚(I:C)、xenoAMP(S)-聚(I:C)和 xenoAMP(M)-聚(I:C)复合物，我们观察到明确的衍射峰，这些衍射峰与液晶有序性相对应，dsRNA 间的相关性为 3. 41 nm（q = 0.184 Å-1）、3.67 nm（q = 0.171 Å-1）和 3.67 nm（q = 0.171 Å-1）（图 2A）。这些异源AMP-poly(I:C)复合物的结构与宿主AMP-dsRNA复合物的结构相同，所有dsRNA间距都在与强免疫激活相对应的值（q10 = 0.17 至 0.19 Å-1）范围内。我们将上述结果与引起普通感冒的人类冠状病毒 HCoV-OC43 株系中的 xenoAMP(ORF1ab) (Control(ORF1ab)) 和 xenoAMP(S) (Control(S)) 的同源物序列进行了比较。SAXS相关峰在Control(ORF1ab)-poly(I:C)和Control(S)-poly(I:C)复合物中受到强烈抑制，这意味着诱导免疫激活的能力要弱得多。

鉴于个体感染和免疫反应的差异，评估上述自组装促炎结构在非最佳条件下的稳健性很有意义。我们研究了当多肽长度偏离高分示例异源AMP序列时，自组装结构的变化程度。我们还研究了肽群异质性对自组装结构的影响。与观察到的 AMP-ness（以 σ 分数衡量）随肽长度变化而变化的稳健性一致，我们发现当参与的异源AMP 短于本文研究的主要示例时，SARS-CoV-2 聚（I:C）复合物的纳米晶体结构得以保留（SI 附录，图 S4A）。在感染中，我们预测来自病毒的各种异源AMPs 会互相共存，并与宿主 AMPs（如 LL-37）共存。作为异质性的一个极端案例，我们研究了 SARS-CoV-2 异源AMPs 在 LL-37 存在的情况下如何与 poly(I:C) 相互作用。数据显示，令人惊讶的是，SARS-CoV-2 异源AMPs 可以与 LL-37 共同结晶成相同的柱状晶格，这表明异源AMPs 和宿主 AMPs 原则上可以协同激活炎症反应（SI 附录，图 S4 B 和 C）。

图 S4. 非理想条件下促炎性 SARS-CoV-2 异源AMP 聚(I:C)复合物的组装

未完待续……

参考文献：

Zhang Y, Bharathi V, Dokoshi T, de Anda J, Ursery LT, Kulkarni NN, Nakamura Y, Chen J, Luo EWC, Wang L, Xu H, Coady A, Zurich R, Lee MW, Matsui T, Lee H, Chan LC, Schepmoes AA, Lipton MS, Zhao R, Adkins JN, Clair GC, Thurlow LR, Schisler JC, Wolfgang MC, Hagan RS, Yeaman MR, Weiss TM, Chen X, Li MMH, Nizet V, Antoniak S, Mackman N, Gallo RL, Wong GCL. Viral afterlife: SARS-CoV-2 as a reservoir of immunomimetic peptides that reassemble into proinflammatory supramolecular complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Feb 6;121(6):e2300644120. doi: 10.1073/pnas.2300644120. Epub 2024 Feb 2. PMID: 38306481; PMCID: PMC10861912.

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