pbs洗涤的作用

一、实验用途

检测目的蛋白表达量

二、实验材料与仪器

PBS，裂解液，ddH2O，30% 预制胶，Tris-HCl (pH8.8)，Tris-HCl (pH6.8)，SDS，APS，TEMED，BCA 的 A 液及 B 液，loading buffer，marker，甲醇，电泳液，转膜液，脱脂奶粉，TBST，一抗及对应二抗，显影 A 液，细胞刮刀，1.5ml 离心管，移液枪及枪头，96 孔板，离心机，电泳槽，PVDF 膜，摇床，曝光机。

三、实验步骤

1. 蛋白样品制备

• 倒掉培养液，PBS 洗涤，弃净 PBS，加入裂解液，置于冰上或 4℃ 冰箱裂解 10min，用细胞刮刀及移液枪将细胞碎片及裂解液移至 1.5ml 离心管，继续裂解 20min。
• 于 4℃ 离心机离心（14000 rpm，15min），取上清，置于 -20℃ 冰箱保存。

2. 蛋白含量的测定（BCA）

• 取出蛋白样品，置于冰上融化。取 4 微升样品，20 倍稀释（4 微升样品+76 微升 ddH2O）。
• 配制 BCA 液（A:B=50:1），在 96 孔板上每孔加入 100 微升 BCA 液，加入 20 微升被试，每个样品重复 3 孔。避光 37℃ 30 min，于 562 nm测定，计算蛋白浓度。

3. 电泳

• 玻璃板夹好，检漏后，加入 10% 分离胶。用移液枪加胶，加异丙醇，约 30 min 后分离胶凝固，倒去异丙醇，加入 5% 浓缩胶。插入梳子，约 30min 后浓缩胶凝固，放入电泳槽。
• 配制上样的样品，100℃ 金属浴 15min，上样，上 marker，60V 电泳，跑过浓缩胶后可加到 120V，跑至底层后可停止。

4. 转膜

• 取适宜大小的 PVDF 膜，浸泡在无水乙醇中 2 in 活化，移入转膜液中浸泡。
• 三明治结构：夹子的黑色一面+海绵垫+三层滤纸+胶+膜+三层滤纸+海绵垫+夹子的透明一面，夹紧。放入转移槽，夹子的黑色一面对槽的黑色一面，夹子的透明色一面对槽的红色一面，放入冰中，或在 4℃ 冰箱转膜，250mA，2.5h。
• 用丽春红染色后切膜，用 TBST 洗净。

5. 封闭

• 以 TBST 作溶剂配制 5% 脱脂奶粉。
• 膜浸泡于 5% 脱脂奶粉，于摇床上低速摇晃，封闭 2 h，弃去 5% 脱脂奶粉，以 TBST 于摇床上高速摇晃，洗涤 5 min，重复三次。

6. 一抗孵育

• 加入一抗，于 4℃ 冰箱孵育过夜。

7. 二抗孵育

• 回收一抗，TBST 洗涤 15 min，重复三次。
• 加入对应的二抗，于摇床上常温孵育 2h，TBST 洗涤 15min，重复三次。

8. 显影

• 将显影 A 液和 B 液以 1:1 配制，将膜浸入显影液 5s 后，即可在曝光机上曝光。

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