pbs的配制方法

一、原理

噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜

（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数 量。

二、试剂材料准备与实验仪器

1）对数生长期细胞

2）受试因素（药物）

3）MTT：以 PBS 配制成 5mg /ml，抽滤除菌，保存在 4˚C

4）DMSO（二甲基亚砜）

5）96 孔板

6）酶联免疫检测仪

7）细胞培养箱

三、实验步骤（适用于贴壁细胞）

1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。

2）置 37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁。

3）加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml 的药物，时间依 据实验需要，一般 3 天。

4）小心吸去上清，PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

5）每孔加入 180 ul 新鲜 RPMI 1640 培养液，再加入 20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即

0.5%MTT），继续培养 4 h。

6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。

7）每孔加入 150 ul 二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS 代替），置摇床上低速 振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。 8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解 介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。

三、结果统计学处理

所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p<0.05 时为相差显著，p<0.01 时 为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求 IC50。 或计算抑制率。

四、注意事项与常见问题 

1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照 孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质， 而加药组加入不同浓度的药物。

 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降 低，太少观察不到差异。

3）贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为20ul/孔。

4）如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 ml，MTT 按照 10%的比例加入。

5）MTT 一般 4 度保存两周，注意避光保存，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存， 避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后 可过滤一下。

6）对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm 有最大吸收值；而对于 SDS 和酸化异丙醇，

则选用 570nm，并且建议以 655nm 作为参考波长。

7）96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分 蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保 证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。 

8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每 接几个就要再混匀一下。

9）没有去掉上清直接加 DMSO，沉淀会很难溶解。加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液 里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心 96 孔板，2000r，5 分钟， 然后吸掉上清。加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。 

10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。

11）除置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶。 

12）关于如何计算 IC50 方法有多种 

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) 

(2)Bliss 法:自己查阅书籍

(3) IC50 计算软件，见下面附件（暂时找不到了）

(4)自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50，关于 LD50 的方法与此相似！

(5)在线求 IC50 或 EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm 13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.

阴庄瑶4688求用于细胞培养的PBS缓冲液的配方以及保存方式. -
聂炭媚19738096354 ______[答案] PBS 1L配方pH7.4: 磷酸二氢钾(KH2PO4):0.27g 磷酸氢二钠(Na2HPO4):1.42g 氯化钠(NaCl):8g 氯化钾(KCl)0.2g 加去离子水约800mL充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调pH至7.4,最后定容到1L. 高温高压灭菌后室温保存.

阴庄瑶4688pbs缓冲液ph=7.4如何配制配置成ph=7.4的pbs缓冲液用K2HPO4和KH2PO4溶液,均是0.2mol/l,比例是怎样的啊? -
聂炭媚19738096354 ______[答案] 0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution,PBS)的配制: 甲液:0.05mol/L Na2HPO4溶液 :称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸 馏水至1000ml ; 乙液:0.05mol/L KH2P04溶液: 称取磷酸二氢钾, 9.07g 6.803g,加蒸馏水至1000m...

阴庄瑶4688如何配制PH值为4.5,5.3,6.5,7.4的PBS(磷酸氢二钠和磷酸二氢钾)缓冲液均为0.033mol/L各配制100ml -
聂炭媚19738096354 ______[答案] 有专门卖的袋装的包装好的缓冲液,一般买的PH计送的有,可以标定PH计用. 或者有些书籍有不同PH值的缓冲液的具体配方比,你可以查一下,然后直接分别称量溶解.如果不需要一定是要配0.033mol/L的PBS的话可以直接先配好0.05 mol/L 的 Na2...

阴庄瑶4688如何配制0.01mol/L,pH7.4的PBS液
聂炭媚19738096354 ______ pbs无非就是磷酸盐缓冲液.我们常用的0.1M的PBS溶液.配方如下,只要10倍稀释即可.0.1M的PBSNacl 8.5克Na2HPO4.12H2O 30.8克NaH2PO4.2H2O 2.8 克双蒸水 定容至1000ml

阴庄瑶46880.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液(PBS)的配制方法 (含0.1mmol/L的EDTA) -
聂炭媚19738096354 ______[答案] 0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution,PBS)的配制:甲液:0.05mol/L Na2HPO4溶液 :称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸 馏水至1000ml ;乙液:0.05mol/L KH2P04溶液:称取磷酸二氢钾,9.07g 6.803g,加蒸馏...

阴庄瑶4688细胞培养的PBS如何制备与消毒? -
聂炭媚19738096354 ______[答案] 将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4•H2O 1.56g,KH2PO4 0.2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液. 高压消毒即可

阴庄瑶4688谁能介绍下pbs制备呢?
聂炭媚19738096354 ______ pbs制备编辑纯硫化铅的制备:铅屑与单斜硫在真空石英管内,加热到1100摄氏度,或PbO与H2S在石英管内加热到500摄氏度,皆可制备

阴庄瑶4688细胞培养的PBS如何制备与消毒? -
聂炭媚19738096354 ______ PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制): 1.溶解定容:将药品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4·H2O1.56g,KH2PO40.2g) 倒入盛有800ml双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解, 调节PH至7.4,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液. 2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内消毒20分钟.注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份.

阴庄瑶4688如何配置PH=8.0的100mM PBS - EDTA缓冲液PBS怎么配?EDTA又怎么配? -
聂炭媚19738096354 ______[答案] 比如配置1L的该溶液,当然是按照PBS缓冲液的组成,以及100mMEDTA计算各化学品所需要的量,然后全部溶解,测定pH值,并用酸或碱把pH值调节到8.0,转移到1L的容量瓶中,加入蒸馏水,然后定容到1L.ok.

阴庄瑶4688pbs溶液的配方在哪里查? -
聂炭媚19738096354 ______ PBS溶液又称磷酸盐缓冲溶液,一般选择K2HPO4和KH2PO4配制,因为钠盐溶解的较慢.根据不同pH的溶液,称量不同质量的磷酸盐,也可以用pH计调溶液的pH.PBS一般用作支持电解质. 其...