pcr模板浓度的计算

1 探针的设计与合成

1) 根据实验室已有的 p8 基因 cDNA 全长序列，用 premier primer5.0 设计引物 p81 和 p82，以卤虫 cDNA 为模板，PCR 扩增得到 346bp 的产物，用 Takara 胶回收试剂盒 回收纯化。

2)\t目的片段克隆

a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在 1:3-1:8，根据凝 胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：

目的 PCR 片段\t5 μl

pGM-T 载体（约 50ng/uL）\t1 μl

10×T4 DNA Ligation Buffer\t1 μl

T4 DNA Ligase（3U/uL）\t1 μl

无菌去离子水\t3 μl

总体积\t10 μl

b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于 PCR 仪中 16℃过夜连接，反应结束后 将离心管置于冰上。

c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入 16 μl 的 IPTG（50mg/ml）、40 μl 的 X-gal（20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于 37℃培养箱 1-3 小时， 使溶解 X-gal 的二甲基甲酰挥发干净。

d.  将 10 μl 的连接产物加到 100 μl DH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于 42℃水浴 90 秒，取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入 500 μl 37℃预热的 LB（不含抗生素）培养基，150rpm 摇床 37℃振荡培养 45 分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于 4000g 下离心10 分钟，去掉上清，加入 100 μl 培养液重溶并加入到配制好的 LB 固体培养基上，用无菌 的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养 12-16 小时。 e.  挑取白色菌落直接进行 PCR 检测，筛选转化子。

f. 将转化子接种于 LB 液体培养基中培养 24 小时，吸取 1mL 菌液送至大连宝生物公司进行 序列测序。

3)\t重组质粒的线性化

取 6 μl 以测序的重组质粒，选取 NcoI 内切酶 37℃酶切 4h。酶切反应体系为 20 μl： 质粒\t6 μl

10xK Buffer\t2 μl

NcoI 酶\t1 μl

0.1% BSA\t2 μl

灭菌水\t9 μl

终体积\t20 μl

取酶切前后的质粒各 4  μl，经 1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用 Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。

4)\t探针合成

按罗氏 DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义 RNA 探针。 使用的所有试剂和器皿均经去  RNase  处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free 的微离心管中顺序加入下列试剂:

纯化的线形质粒\t1 μg

Rnase-free dH2O\t\tup to 13 μl 10xNTP labeling mixture\t2 μl

10xTranscription buffer\t2 μl

Rnase inhibitor\t1 μl

SP6 RNA Polymerase\t2 μl

总体积\t20 μl

稍混匀，短暂离心将反应液集于管底，37℃ 2 h。反应结束后再补加 2 μl DNase I，37℃ 15 min，反应结束后加入 0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取 3-5 μl 反应产物 1%琼脂糖凝胶电泳 检测。-20℃保存备用。

2. 石蜡切片的制备

◆本实验在杂交结束前均必须保证 RNase-free.玻璃器皿采用 180℃烘烤 10 小时。其它采 用 DEPC 处理，高温灭菌锅高温降解 DEPC。若仪器不能高温处理，可用 3%的 H2O2 处理 半小时以上，DEPC 水冲洗干净，烘干。

1)\t组织的固定与包埋 选取不同发育时期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的卤虫，经 DEPC 处理水冲洗表面盐分后，加入新鲜配制的 4%多聚甲醛，于 4℃固定 5-8 h，再分别按下列 顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水 1 h，50%乙醇脱水 1 h，70%乙醇脱水 1 h，80%乙醇脱水乙醇脱水 1 h，90%乙醇脱水 1 h，无水乙醇脱水 1 h，无水乙醇脱水 1 h，无水乙醇:二甲苯(1:l)透明 10 min，二甲苯透明 10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1)浸蜡 30 min，54℃石蜡浸蜡 1 h，54℃石蜡包埋。

2)\t组织切片：将包埋的组织按 7 μm 的厚度切片，在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加 DEPC处理水，组织片于 42℃展片台上展片 1 小时，再置于 40℃恒温箱中烘片 12 小时后放于 4℃密封保存备用。

3. 杂交前处理

切片经二甲苯脱蜡 2×15 min，无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30% 乙醇脱水各 5 min，后 DEPC 处理水 2×5 min，然后进行杂交前切片处理，具体步骤如下: 1)    lxPBS(pH7.4)室温孵育 2x5 min。

2)  0.3%TtitonX-100 的 PBS 中去膜处理 15 min。

3)  lxPBS 洗涤 2x5 min。

4)  无 RNase 的蛋白酶 K(20 mg/mL)37℃消化 30 min。

5) 100mMGly/PBS 中洗 2x5 min。

6) lxPBS 洗涤 2x5 min。

7)    4%多聚甲醛(4℃)固定 5min。

8)  lxPBS 洗涤 2x5 min。

9)\t含有  0.25%(W/v)的乙酸酐的  100mM  的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电荷处理  15 min(现配现用)。

10) lxPBS 洗涤 2x5 min。 

4.预杂交和杂交

1)  滴加预杂交液于载玻片上，然后置于湿盒中，50℃预杂交 2 小时。

2)    弃去预杂交液，立即滴加杂交液，置于湿盒中 52℃杂交过夜。

5.杂交后处理 杂交完，以后的步骤不必要特意防 RNA 酶。

1)\t弃去杂交液，载片浸入 2xSSC 中 2x15 min。

2)\t载片浸入 1xSSC 中 55℃水浴摇动 2x15 min。

3)\t用含 20mg/mL 的 RNaseA 的 NTE 缓冲液 37℃消化 30 分钟，以去除未结合的探针。

4)\t载片浸入 0.5xSSC 中 55℃水浴摇动 2x15 min。

5)\t载片浸入 0.5xSSC 中室温 10 min。

6. 抗体反应

1)\t用 washing buffer 清洗组织片 5 min。

2)\t滴加封闭液缓冲液室温下处理组织片 30 min。

3)\t用抗体液覆盖封闭后的组织片，置于湿盒中孵育 3h 以上。

4) Washing buffer 洗 2x15 min。

5) Detection buffer 中平衡 2-5 min。

7.  显色：加入显色液于湿盒中黑暗静止显色 16h

8. 封片与观察：

1)\t显色合适时，用 TE buffer 终止着色反应，再用蒸馏水清洗。

2)\t滴加封片剂封片，显微镜下观察和摄影。

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