pi3k+akt通路全称

2024年1月保定市第一中心医院耿红玉教授团队于《Int Immunopharmacol》（IF=5.6）杂志上发布了文章：Sivelestat ameliorates sepsis-induced myocardial dysfunction by activating the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway，本研究旨在探讨西维来司他钠在脓毒症诱导心肌功能障碍(SIMD)中的作用机制。结果显示：西维来司他钠在体内和体外均可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗SIMD的作用。

脓毒症是由宿主对感染的异常免疫反应引起的器官功能障碍，是院内死亡最常见的原因。全世界约有5000万患者被诊断为脓毒症，其中约50%的脓毒症患者出现心肌功能障碍（SIMD），心脏是最容易感染脓毒症的器官。脓毒症引起的SIMD以心室扩张、射血分数降低、收缩力降低为特征，且与SIMD死亡率的显著增加相关。SIMD的发病机制包括循环心肌抑制物质(如TNF-α和IL-1β)的过量产生和释放、肾上腺素能通路的抑制、活性氧的过量产生、钙处理异常和线粒体功能障碍。然而，SIMD的生理病理机制尚不完全清楚。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路是一种重要的细胞内信号转导途径，通过调节细胞存活、生长、增殖、血管生成、转录、翻译、自噬和凋亡来调节生物稳态。PI3K/AKT/mTOR信号通路在慢性缺血性心力衰竭的氧气输送、葡萄糖利用和线粒体生物发生中发挥重要作用。此外，激活PI3K/AKT/ mTOR信号通路可减少炎症因子和细胞凋亡，减轻心肌细胞缺血再灌注损伤。

中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase, NE)是中性粒细胞释放的一种主要丝氨酸蛋白酶，介导宿主对细菌感染的先天防御，在杀灭病原体、调节炎症和组织稳态等方面发挥重要作用。然而，过多的NE释放可引起炎症性疾病的组织损伤，包括肺炎、急性肺损伤、肾损伤、类风湿关节炎和心肺疾病。西维来司他钠是一种高度特异性和有效的中性粒细胞弹性蛋白酶合成抑制剂，广泛用于治疗急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征。此外，它还能减轻NE释放过多造成的器官损伤。然而，西维来司他钠对心脏的保护作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨西维来司他钠对SIMD的潜在保护机制。

1 脂多糖和西维来司他钠浓度对细胞活力的影响

CCK-8实验显示，10 μg/mL的LPS处理使H9c2细胞的活力降低至50 - 60%(图1A)。因此，选择10 μg/ml LPS进行进一步实验。此外，CCK-8实验显示，1 μM西维来司他钠可显著提高细胞活力(图1B)；因此，选择1 μM的西维来司他钠进行后续实验。

图1：不同浓度脂多糖(LPS)和西维来司他钠对H9c2细胞的影响。(A) CCK-8法检测不同浓度LPS(0、0.1、1、10、100 μg/ml)处理后的细胞活力。(B) H9c2细胞用不同浓度的西维来司他钠(0.1、1、10 μM)孵育2 h后，再用LPS (10 μg/ml)处理，采用CCK-8法检测细胞活力。所有样品一式三份，实验重复三次。数据以平均值±标准差表示。* P < 0.05,* * P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001 vs.对照组;####P < 0.0001vs.LPS组。ns:无显著差异。

2 西维来司他钠可减轻脂多糖诱导的H9c2细胞凋亡

TUNEL染色显示，西维来司他钠显著降低了LPS刺激的H9c2细胞中TUNEL阳性细胞核的比例，表明西维来司他钠在体外对LPS诱导的凋亡具有保护作用(图2A)。Western blot分析显示，在LPS组中，caspase-3和bax表达上调，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调。此外，在脂多糖处理的H9c2细胞中，西维来司他钠的应用与Bcl-2蛋白升高、caspase-3和bax表达降低相关，这表明西维来司他钠对LPS诱导的细胞凋亡具有保护作用(图2B-2E)。

图2：西维来司他钠可减轻脂多糖(LPS)诱导的H9c2细胞凋亡。(A) H9c2细胞TUNEL染色的代表性图像。标尺，50 μm。红色荧光标记凋亡细胞，蓝色荧光标记细胞核。分析各组细胞凋亡百分率。(B) western blotting检测caspase -3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平;(C-E) 定量测定Caspase-3/肌动蛋白、Bcl-2/肌动蛋白和Bax/肌动蛋白水平。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001;#P < 0.05，##P < 0.01与LPS组比较。数据以平均值±标准差表示。

3 心脏功能和存活率

采用超声心动图评估心功能。CLP治疗与较低的LVEF相关。此外，与CLP组相比，CLP + Siv组LVEF升高；然而，当使用LY294002时，这种效果减弱(图3A)。72h后，CLP + Siv组的存活率明显高于CLP组，而西维来司他钠在CLP + Siv + LY组的保护作用被逆转(图3B)。上述结果提示，西维来司他钠可保护心功能，提高CLP模型的存活率。假手术组心脏超声心动图正常，CLP组心室扩张，收缩功能受损。超声心动图显示CLP + Siv组改善，而CLP + Siv + LY组则相反(图3C)。

图3：西维来司他钠可改善脓毒症大鼠的心功能和存活率。(A) LY294002 (10 mg/kg)在西维来司他钠治疗前30分钟腹腔注射。在经典结扎和穿孔(CLP)手术前2小时腹腔注射西维来司他钠(100 mg/kg)。CLP术后12 h测量左心室射血分数(LVEF) (n = 10)。。*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,****P < 0.0001vs.对照组；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001vs.CLP组；%P < 0.05，%%P < 0.01vs.CLP +Siv组。数据以平均值±标准差表示。(B)记录72h内大鼠的死亡率(n = 10只大鼠)。CLP + Siv组的生存率显著高于CLP组，而CLP + Siv + LY组的生存率显著低于CLP + Siv组(P < 0.05)。(C)假手术组、CLP组、CLP + Siv组、CLP + Siv + LY组的代表性超声心动图图像。

4 西维来司他钠可预防心肌损伤，减轻心肌炎症

西维来司他钠显著抑制了CLP组心脏组织的组织学改变，包括心肌细胞坏死、炎症细胞浸润和出血(图4A)。此外，西维来司他钠显著降低CLP诱导的血清cTnT、TNF-α和IL-1β水平，而其保护作用被LY294002逆转(图4B-D)。同时测定心肌TNF- α、IL-1β水平，结果与血清TNF-α和IL-1β水平一致(图S1)。这提示西维来司他钠能预防心肌损伤，减轻心肌炎症。

图4：西维来司他钠可预防脓毒症大鼠心肌损伤，减轻心肌炎症。(A)苏木精和伊红染色结果(n = 10只大鼠;标尺，50 μm)。(B) ELISA检测血清心肌肌钙蛋白(cTnT)水平(n = 10只大鼠)。(C) ELISA法检测血清TNF-α水平(n = 10);(D) ELISA法检测血清IL-1β水平(n = 10)。* P < 0.05,* * P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001vs.对照组；# P < 0.05, ##P < 0.01, # # # P < 0.001; # # # # P < 0.0001 vs.CLP组;%P < 0.05，%%P < 0.01vs.CLP +Siv组。数据以平均值±标准差表示。

5 西维来司他钠在体外和体内激活PI3K/AKT/mTOR信号通路

TUNEL染色显示，与LPS (CLP)组相比，LPS (CLP) + Siv组TUNEL阳性细胞比例显著降低;然而，LY294002逆转了这种效应(图5A和5H)。Western blot分析显示，LPS诱导的H9c2细胞和CLP相关的大鼠心脏组织中p-AKT和pmTOR均下调；然而，西维来司他钠在体内和体外均上调了p-AKT和p-mTOR的表达水平。加入LY294002后，p-AKT和p-mTOR的蛋白表达水平显著降低(图5B、5C、5D、5I、5j和5k)。此外，西维来司他钠在体内和体外显著增加了Bcl-2的表达，降低了Caspase-3和Bax的表达，但LY294002处理逆转了这种保护作用(图5B、5E、5F、5G、5I、5L、5M和5N）。这些结果表明，西维来司他钠在体内和体外均可激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，而LY294002可逆转其对PI3K/AKT/mTOR信号通路的保护作用。

图5：西维来司他钠在体内和体外均激活了PI3K/AKT/mTOR信号通路。(A) TUNEL染色的红色凋亡细胞，DAPI染色的蓝色H9c2细胞核。比例尺，50 μm；(B)西维来司他钠、LY294002和LPS对H9c2细胞中p-AKT、p-mTOR、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平的影响。(C-G)统计分析。(H) TUNEL染色的绿色凋亡细胞和DAPI标记的蓝色大鼠心脏组织。标尺，50 μm。(I)西维来司他钠、LY294002和CLP对CLP大鼠p-AKT、p-mTOR、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平的影响。(J-N)统计分析。* P < 0.05, **P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001vs.对照组;# P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001vs.LPS组或CLP组；%P < 0.05，%%P < 0.01，%%%P < 0.001，%%%%P < 0.0001vs.LPS +Siv组或CLP +Siv组。数据以平均值±标准差表示。

本研究表明，西维来司他钠可以通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路对SIMD起保护作用。同时，这些结果也阐明了西维来司他钠的分子作用机制，将有助于开发新的SIMD治疗策略。

参考文献：

doi: 10.1016/j.intimp.2023.111466. Epub ahead of print.返回搜狐，查看更多

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