pmd18-T载体

郑沫娄971关于t载体基因工程中常提到t载体(t - Vector),请问什么是t载体,t载体有什么作用 -
桂樊阁17549514707 ______[答案] 通过克隆甘露聚糖酶基因到pMD-18T载体构建了质粒pMD-18Tman2XcmI,克隆的甘露聚糖酶基因两侧各引进了一个特定的XcmI 酶切位点;用XcmI酶切质粒pMD-18Tman2XcmI可以制备T载体.因为甘露聚糖酶基因作为填充片段和筛选标记...

郑沫娄971在使用pMD18之类的T载体时,怎样加A,加A是必要的吗 -
桂樊阁17549514707 ______ 博凌科为-为你解答:PCR中的taq酶一般是直接加A的,也就是你PCR做完只要割胶纯化就可以直接连了,不用额外想着加A什么的.但是要注意的是PCR反应后不能放置太久,一般当天就做T-A克隆,最好不要超过2、3天,越早做越好,因为即便放在-20也是会掉A,这样肯定就很难做T-A克隆了,有人隔了5天左右再做就发现已经很难转化到了,甚至是没有长.

郑沫娄971pmd18 - t如何与指定DNA结合 -
桂樊阁17549514707 ______ 不能结合.重新设计PCR引物,在两端加入限制性酶切位点,或者pmd 18-t MSC上任意酶切位点的3'和5'同源DNA,以你现在的DNA产物为模板重新进行PCR扩增后,利用Ligation或者In-fusion将你的DNA片段插入载体.

郑沫娄971什么是生物克隆中的Control反应 -
桂樊阁17549514707 ______ 就是用Takara 的载体(pMD18-T Simple Vector),加上Takara提供的DNA片断(Control Insert),来做一个对照实验(Control反应),可用来检测一下这批载体是否有问题.

郑沫娄971为什么基因与载体连接后直接泡胶但是什么条带都没有 -
桂樊阁17549514707 ______ “单酶切可以切开,而且质粒的大小明显小于空质粒”,首先你的表达有误,单酶切可以切开,说明目的基因有连接上,那么重组载体该是比空载大的.质粒稀释100倍后PCR,有目的条带,也说明了是阳性克隆.有拖带,你可以把退火温度提高试试.后面上样9ul目的条带很浅,应该是你稀释倍数太高了.我一般是不稀释的,直接PCR,不过得看你提取质粒时加多少体积的水溶. 我觉得不需要另外转入空载,PMD18-T vector的连接率挺高的.只要挑取阳性克隆抽质粒,经酶切、PCR后有目的条带就可以拿去测序了.如果PMD18-T vector只作为中间载体,可亚克隆到其他载体

郑沫娄971已知某肽基因全长120bp.拟通过DNA重组技术构建含6*his标签的重组融合蛋白...
桂樊阁17549514707 ______ 根据目的基因序列设计引物;PCR目的基因片段;跑胶,产物回收,纯化;连接T载体(如PMD18t);转化宿主菌;筛选单克隆;测序;大量培养,提取重组质粒;酶切,电泳,回收,纯化,连接表达载体(如pET系列),转化;筛选单克隆;...

郑沫娄971连接转化后挑菌落,测序是混合克隆,是怎么回事 -
桂樊阁17549514707 ______ 挑出几个菌落直接培养测序是不适当的.菌落中有很大一部分比例转进去的是空载体,没有成功连入目的基因片段.所以要多挑一些单菌落,培养后用菌液PCR或者提质粒后双酶切鉴定是否连入目的基因,选择成功连入目的基因(阳性克隆)的再拿去测序.你现在的测序结果,很有可能只是载体本身的序列. 质粒如果需要测序,说明你们实验室对这个质粒中插入的基因序列不清楚,需要通过测序知道其中到底是什么基因,绝大多数情况下是做了克隆之后需要去确认插入到目的载体中的序列是不是正确,这样才能进行下一步的实验.PCR产物测序一般是为了确认PCR产物序列的正确,因为PCR过程中有可能会发生突变或者其他导致序列改变的情况,只有确认之后才能进行后续实验.

郑沫娄971急,如何构建原核表达载体 -
桂樊阁17549514707 ______ 大体分为一下几步: 1.设计目的片段引物(含限制性酶切位点,要求:表达载体上有而目的片段上没有的酶切位点) 2.PCR扩增片段 3.扩增后的片段与pMD18/19T克隆载体连接,通过蓝白斑筛选,提质粒并酶切鉴定;将正确连接的克隆载体重组质粒酶切,回收目的片段 4.目的片段与表达载体连接 5.转化到DH5a等克隆菌株,通过抗生素筛选,鉴定表达重组质粒. 6.测序检测 7.正确的表达重组质粒再转到表达菌株 8.表达

郑沫娄971菌液测序,但有一半序列反转互补后才是我要的序列,如果拿这样的序列去做表达分析,会影响表达结果吗? -
桂樊阁17549514707 ______ 原因可能是两边的酶切位点是同一种酶,连接的时候就可能出现反接的情况.下次可以考虑用双酶切体系避免这个问题.用来作为融合蛋白的一部分的基因如果反接是无法得到正常的产物的,况且本身的反接应该也会造成自身产物的错误(因为序列是反向而转录还是从5·-3·),所以...应该可以扔了.同理,缺失片段的也不能用,而且100bp的缺失肯定会造成移码的吧(因为不是3的倍数). 没做过酵母单杂交,有答错的可能.

郑沫娄971请教基因克隆连接载体PTG - 19T的精确大小 -
桂樊阁17549514707 ______ 2880bp