ros组织染色步骤

压疮 (PU) 是一个重大的全球健康问题，每年影响约300万人。它们是由于皮肤和皮下组织长时间受到压力或摩擦，导致局部缺血、缺氧和营养供应不足，最终导致组织损伤和坏死。PU最常见于脂肪组织保护减弱的区域，例如老年人、营养不良、瘫痪或卧床不起的个体。除了引起不适和疼痛之外，压疮还会增加感染、并发症和潜在危及生命的风险。因此，压疮的治疗至关重要。压疮部位持续性感染会导致抗炎因子过度分泌以清除感染病原体。抗炎因子的累积引起局部炎症微环境失调，巨噬细胞向M1型极化，产生大量基质金属蛋白酶，降解已经产生的细胞外基质，并且破坏血管再生，从而导致压疮迁延不愈。

针对上述问题，我们团队联合广东省中医院邓丽丽、刘旭生团队开发了一种新型水凝胶敷料。该水凝胶敷料以明胶和聚赖氨酸为基材，分别接枝苯硼酸（Gel-PBA）和邻苯二酚（ε-pL-Cat）进行化学改性，通过硼酸酯键的交联，形成自愈合动态水凝胶。此外，该水凝胶还具备抗菌、抗氧化等多种特性。团队针对专利产品：川红通络贴，挖掘其中的功效组分——红花多糖，将红花多糖制备成水凝胶微球（CTLP-MPs），负载在上述自愈合水凝胶中，通过响应感染创面低pH值释放红花多糖，促进血管化，协同水凝胶实现强抗菌和免疫调节作用。该工作以“Antibacterial, ROS scavenging and angiogenesis promoting epsilon-Polylysine/gelatin based hydrogel containing CTLP to regulate macrophages for pressure ulcer healing”为题发表在生物制造领域权威期刊《Biofabrication》（DOI：10.1088/1758-5090/ad2d2e）上。邓丽丽主任、刘旭生主任和郭瑞研究员为该文的通讯作者。

图1 研究示意图

1）GPL水凝胶具有自愈合性和粘性

Gel-PBA和ε-pL-Cat制备的GPL水凝胶具有良好的自愈合性，切断的水凝胶接触后可立即恢复成整体。GPL水凝胶性质柔软，对塑料和组织器官（心、肝、脾、肺、肾）具有良好的粘性。通过微流控法制备的红花多糖微球尺寸均匀，带有红花的淡黄色。

图2 水凝胶的理化性质评价

2）GPL水凝胶有显著抗菌作用，并且红花多糖会协同加强抗菌效果

水凝胶对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）均表现出良好的抗菌性，与多西环素的抗菌效率相当，还能抑制生物膜形成（图3A-E）。聚赖氨酸表现出强大的抗菌性，并且红花多糖也具备一定的抗菌作用，加入红花多糖微球后，在琼脂平板上几乎观察不到菌落生长。经过水凝胶处理后，观察到大量红色荧光标记的死细菌，展现了GPL和GPL/CTLP-MPs水凝胶强大的抗菌作用（图3C）。

图3 水凝胶的体外抗菌作用评价

3）GPL水凝胶生物相容性良好，红花多糖能够提高VEGF的表达以增强血管形成

聚赖氨酸除了具备广谱抗菌性，还具有促进细胞粘附的作用，常用作细胞爬片或孔板的包被材料。GPL和GPL/CTLP-MPs水凝胶与细胞培养的活死荧光染色和细胞骨架染色结果显示，水凝胶无细胞毒性，细胞生长状态良好（图4A-C）。并且有鱼聚赖氨酸的加入，具备一定的促进细胞迁移的作用（图4D-E）。为了评估红花多糖的血管化作用，研究人员通过体外成管实验评估了水凝胶对HUVEC细胞的作用。红花多糖的加入能够促进血管网络形成，并且增加了血管化相关蛋白VEGF的表达（图4F-G）。

图4 水凝胶的体外相容性、划痕实验和血管化评价

4）GPL水凝胶具有优异的ROS清除和巨噬细胞调控作用

邻苯二酚具有优异的ROS清除作用，DCFH-DA探针观察到GPL和GPL/CTLP-MPs水凝胶处理后的细胞，几乎观察不到ROS荧光，表现出明显的ROS清除作用（图5A-B）。同时对LPS诱导的RAW264.7细胞具有显著的极化调节作用，明显促进M2巨噬细胞群增加（图5C-E）。

图5 水凝胶清除细胞ROS、促进巨噬细胞向M2表型极化

5）红花多糖能够促进压疮血管化作用，提高愈合质量

C57BL/6小鼠通过强力铷磁铁的压力，进行4个缺血再灌注循环后形成压疮。经过水凝胶治疗后，创面愈合质量得到了良好的提升。使用GPL/CTLP-MPs水凝胶治疗的组在治疗10天后几乎完全愈合，而其他三组仍然有结痂。治疗14天后，所有组均实现伤口完全愈合（图6A）。对压疮组织进行VEGF免疫组织化学染色，治疗3天后，GPL/CTLP-MPs水凝胶组的VEGF表达较对照组升高，7天后仍维持较高水平，14天后表现出显着增加，表明红花多糖具有促进血管生成的能力（图6C）。

图6 对压疮小鼠的治疗效果评价

本研究证明了基于明胶和聚赖氨酸改性的GPL水凝胶在抗菌和免疫调节中的有效性，同时发现红花多糖具有协同抗菌和增强血管化的作用，极大地提高了压疮愈合的质量，为红花用于压疮修复提供了工作基础。

原文链接：

https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2d2e/meta

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