sds凝胶电泳注意事项
1.5 mol/L Tris (PH8.8)
1．称量181.7gTris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）
1 mol/L Tris (PH6.8)
1．称量121.1gTris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值 | 浓HCl |
6.8 | |
7.4 | 约70 ml |
7.6 | 约60 ml |
8.0 | 约42 ml |
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）
30％丙稀酰胺（100ml）
1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） | 29 g |
双丙烯酰胺 (BIS) | 1 g |
2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml,用0.45 µm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
30％SDS
1．称量10 g高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。
4．定容至100 ml，室温保存。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
10％过硫酸铵
1．称量1 g过硫酸铵。
2．加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。
3．储存于4oC。
注意：10％过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。
（参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
1×SDS凝胶加样缓冲液
50 mmol/L | Tris·Cl (pH 6.8) |
100 mmol/L | DTT |
2% | SDS （电泳级） |
0.1% | 溴酚蓝 |
10% | 甘油 |
不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。
（参照《分子克隆》二版P884）
本人将参照此配方，配成5×或6×，各成分浓度均扩大5倍。
另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS－PAGE Loading Buffer配方：
组分浓度：
250 mmol/L | Tris·Cl (pH 6.8) |
10% (W/V) | SDS （电泳级） |
0.5% (W/V) | 溴酚蓝（BPB） |
50% (V/V) | 甘油 |
5% (W/V) | β-巯基乙醇（2-ME） |
配制量5 ml
配制方法
1．称量下列试剂置于10ml塑料离心管中。
1 M Tris·Cl (pH 6.8) | 1.25 ml |
SDS （电泳级） | 0.5 g |
溴酚蓝（BPB） | 25 mg |
甘油 | 2.5 ml |
2．加去离子水溶解后定容至5 ml。
3．小份（500 ul/份）分装后于室温保存。
4．使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
5．加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
1 mol/L DTT(20 ml)
1．称取3.09 gDTT，加入到50 ml塑料离心管中。
2．加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。水配
3．分装后－20oC保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
3 M醋酸钠（NaOAc）（100 ml）
1．称取40.8 gNaOAc·3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
2．加冰醋酸调节pH值至5.2。
3．定容至100 ml，高压灭菌后室温保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
0.01 MNaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。
5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）
组分浓度：0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS
1．称量下列试剂置于烧杯中。
Tris | 15.1 g |
Glycine | 94 g |
10%(W/V) SDS（电泳级） | 50 ml 或5g SDS |
2．加入约900 ml去离子水搅拌溶解。
3．定容至1L，室温保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
Transfer Buffer:
[自配]Transfer Buffer:500ml
25mMTris base, 0.2M glycine（甘氨酸）, 20% methanol(甲醇PH8.5)
先配制1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至100ml,调PH8.5（1L约加22ml浓盐酸）
1M12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol + ddH2O 至400ml,调好PH值，再加ddH2O至500ml.
先置于4oC保存备用。
（参照吴兴军给Protoco,据说优于《分子克隆》配方）
丽春红S储存液（10×）
丽春红S | 2 g |
三氯乙酸 | 30 g |
磺基水杨酸 | 30 g |
加水至100 ml。 |
用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液，使用后应予废弃。
10X TBS (Tris-buffered saline):
To prepare 1 liter of 10X TBS:24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).
（参照Cell signal Technology Protoco）
Wash Buffer TBS/T:（0.05%吐温）可用PBST代替
1X TBS, 0.1% Tween-20
[自配] Wash Buffer TBS/T:1000ml
1×TBS,0.1%Tween-20,100ml 10×TBS+ 1ml Tween-20+ 900ml ddH2O
（参照Cell signal Technology Protoco）
Blocking Buffer:（3%BSA的TBST或PBST）封闭
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。
[自配]Blocking buffer:150ml
for 150ml, add 15ml 10×TBS to 135 ml water,mix.Add7.5g nonfat milk and mix well.While strirring,add 0.15ml Tween-20(100%).
(现用现配，4oC储存备用)
（参照Cell signal Technology Protoco）
Primary Antibody Dilution Buffer:抗体稀释（1%BSA TBST或PBST，不加BSA也可）
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% blocking agent;
for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add1.0 g BSA and mix well. While stirring, add 20 µl Tween-20 (100%).
（参照Cell signal Technology Protoco）
显色液（好用）
5mg DAB；200ul 1M Tris（PH=8.5，常用作纯化液母液）；9.5ml水，静置5min（加入Tris缓冲液会变浑浊），加入3.5ul 双氧水，现用现配，可配好无双氧水的10X母液分装，-20℃保存，1ml/支，用时稀释到10ml并加入3.5ul双氧水即可使用。
本实验室SDS-PAGE电泳凝胶配方如下：
慎傅民2061为什么测定蛋白质的乳化性的时候要以SDS为空白 -
酆韵之13315998703 ______ 为什么测定蛋白质的乳化性的时候要以SDS为空白 注意事项 (1)由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;剥胶时凝胶板易断裂,为防止引现象,所用器材...
慎傅民2061电泳时要注意些什么? -
酆韵之13315998703 ______ 主要注意一下几点: 凝胶正负极不要弄反向了, 控制电压及电泳时间,严控条带跑出 点样时,点样量不要溢出点样孔,注意枪头捅破点样孔的凝胶. 电泳时需要marker做对照,用于验证目拟标片段的大小, 电泳缓冲液需定期更换 相信做到以上几点,应该问题不大
慎傅民2061电泳时要注意些什么? -
酆韵之13315998703 ______[答案] 主要注意一下几点: 凝胶正负极不要弄反向了, 控制电压及电泳时间,严控条带跑出 点样时,点样量不要溢出点样孔,注意枪头捅破点样孔的凝胶. 电泳时需要marker做对照,用于验证目拟标片段的大小, 电泳缓冲液需定期更换 相信做到以上几点...
慎傅民2061提高SDS - PAGE电泳分辨率的途径? -
酆韵之13315998703 ______ 1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率.建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用.忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶.一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺. 2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103. 更详细的内容可以登录生物帮的, http://www.bio1000.com/reseach/drug/ 生物药物开发科研进展,药物研究,新药研究,生物技术药物,生物药品.
慎傅民2061SDS - 聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理是什么 -
酆韵之13315998703 ______ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法.在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离. 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点: ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子...
慎傅民2061琼脂糖凝胶电泳使用什么染色?需要注意什么问题? -
酆韵之13315998703 ______ 琼脂糖凝胶电泳的染料有许多种,近几年较常用的有: EB-溴乙锭,EB有较大毒性,可致癌,所以使用时一定要万分小心.EB染色的背景较强. SYBR Green--也叫荧光绿如蓝,低毒性,但检测灵敏度没有EB高. GelRed--号称无毒,无皮肤渗入型,有伤口就不好说了.背景荧光弱,但加多了容易出现拖带.由于在市场上价格较高,所以有出现很多仿冒货,买时要擦亮眼睛.
慎傅民2061用什么进行蛋白质纯度的鉴定 -
酆韵之13315998703 ______ SDS 聚丙乙烯酰胺凝胶电泳 考马斯亮兰法双缩脲法(Biuret法)和Folin—酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法. 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白...
慎傅民2061SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 -
酆韵之13315998703 ______ 你的样品是不是浓度太高了,所以蛋白质都聚集沉淀了?你也可以先检查一下电路是否有问题,不排除是电泳电源不好使;另外你的电流有点高,可能是电流大导致过热,凝胶变性
慎傅民2061什么是SDS - 凝胶电泳法
酆韵之13315998703 ______ 蛋白质分子量测定较多用的是SDS(十二烷基磺 酸钠) 凝胶电泳法,这种方法最适宜的测定分子量是 15000~100000 的样品,对低于10000 分子量的水解 蛋白不太适用.通过改进,用强电解质离子为前导离 子和拖尾离子,可对分子量低于10000 的水解蛋白样 品进行分子量测定.
慎傅民2061双向电泳第二步SDS - PAGE跑胶的问题 -
酆韵之13315998703 ______ 1, 提取蛋白的时候要充分超声粉碎,然后高速离心.吸取上清的时候不要触到沉淀.污染不一定是RNA和DNA,还有可能是胶里面有杂质. 2. 遇热膨胀过度,你可以在电泳槽里面安放冰槽,电泳液预先降温,同时降低电泳时的电流.还有配琼脂也要用缓冲液,而不是水,不然不导电. 接触不好也会引起条带变形