sds法提取动物dna
[实验原理]
在 EDTA 和 SDS 等去污剂存在下,用蛋白酶 K 消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳 动构基因组 DNA,用此方法得到的 DNA 长度为 100-150 kb,适用于 L 嘴菌体构建基因组 文库和 Southern 分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组 DNA 的原理和步骤,以及相对分子质量较大的 DNA的 琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1.台式离心机
2.玻璃匀浆器
3.高压灭菌锅
4.恒温水浴
(二)材料
1.1.5mL 微量离心管
2.微量取样器和吸头
3.无菌过滤器(一次性)
4.10 mL 注射器
5.鼠肝
6.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
7.十二烷基硫酸钠(SDS)
8.乙二胺四乙酸(EDTA)
9.蛋白酶 K
10.RNA 酶
11.DNA 相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物
(三)试剂
1、1.5 mol/L\tNaCl
2、0.5 mol/L Tris·HCI\tpH8.0
3.0.5 mol/L EDTA\t\tpH8.0
4.3 mol/L NaAc\tpH5.2 以上均高压灭菌。
5.蛋白酶 K 10mg/mL 配好后用一次性过滤器过滤,-20 保存(教师配制)
6.组织匀浆液 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/ LEDTA(pH8.0)
7.酶解液 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL 蛋白酶 K,1%SDS
8.无 DNA 酵的 RNA 酶 : 将胰 RNA 酶溶解于 10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L NaCl 溶液中,浓度 l0mg/mL,于 100℃水浴处理 15min,以降解 DNA 酶,缓慢冷 却到室温,-20℃保存
9.TE 缓冲液 :10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)
10.平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1<体积比)
11.氧仿:异戊醇=24:l(体积比)
12.5xTBE 5.4gTris,2.75g 硼酸 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到 100mL;
13.6x 上样缓冲液 o.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液
14.λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP)21 227,5148,4 973,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125
[实验步骤]
本实验在无液氮的条件下,铡备鼠肝 DNA,与有液氮条件下相比,产量和质量都有所下 降。整个操作过程中,应尽量避免 DNA 酶的污染,特 g4 注童动作温和,减少对 DNA 的 机械捌伤。
1、取 0.2g 鼠肝,用冰冷的生理盐水洗 3 次,然后置于 2.0mL 匀浆掖中,用玻璃匀浆器匀 浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切匆将细胞破碎,可镜检观察)。
2、将组织细胞移至 1.5ml 离心管中,50000rpm 离心 30-60sec,(尽可能在低温下操作), 弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入 1 倍于细胞体积的匀浆液洗一次。
3、沉淀加 0.8mL 无菌水迅速吹散,分两管,再加 0.4mL 酵解液,翻转混匀(动作一定要 轻)55℃水浴处理 12-18 h;
4、沉淀加 RNase 至终浓度 200µg/mL,37℃水浴 1 h;
5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次,(慢慢旋转混勾,倾斜使两相接触面增大)。4℃、 10min、10000rpm 离心;
6、有时如果 DNA 含量过高,水相在下层,实验时应注意观察。用扩口吸头移出含 DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等体积氧仿/异戊醇,4℃、10 000rrpm 离心 10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重复 1.6 操作)。
7、用扩口吸头小心吸出上层含 DNA 的水相,加 1/10 体积的 NaAc,小心混匀(要充分), 再向每管中加入 2.5 倍体积的无水乙醇,-20 过夜。
8、12 000rpm 离心 19min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000rpm 离心 15min 室握温干燥(不要大干,否则 DNA 不易溶解),加入适量 TE 缓冲液,存放于 4℃,轻摇溶解过夜,即可得 到实验动物基因组 DNA。
9、电泳鉴定 DNA,由于基因组 DNA 相对分子质量较大,用 0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定, 先在底部锦一层 1%的支持胶,凝固后再铺上一层 0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(枚子不能瑾 到的支持胶)。取 1.5µL 溶解的 DNA、1µL 上样缓冲液和 35µl 无菌水混匀后小心上样(可在 另一孔加 DNA 相对分于质量标准),观察基因组 DNA 大小,用溴化乙锭染色观察结果。
[注意事项]
1、操作过程尽量在低温下进行,避免 DNA 降解。
2、琼脂糖凝胶脆弱,应小心操作。
3、提取得到的基因组 DNA 应为单一条带,DNA 降解可形成弥散带型。
管婕义4319DNA提取的方法有几种分别是什么,哪种是现在最常用的?
堵龚岩15619865007 ______ 关于DNA的提取方法在《分子克隆》一书中有详细介绍,其中最常用的质粒提取方法包括: SDS碱裂解法制备质粒DNA煮沸裂解法制备质粒DNA牙签法小量制备质粒DNASDS裂解法提取质粒DNA 这其中SDS碱裂解法又是最常使用的提取方法. 当然针对不同组织样品DNA的提取方法是不同的,具体还是要参考《分子克隆》等工具书. 另外,针对不同组织的DNA样品,就是都有很多成熟的试剂盒可以使用.如果不是大批量使用或者经费充足的话,可以考虑购买试剂盒,一般可以提取到更高质量的DNA,并且也可以节约不少自己摸索的时间.
管婕义4319请问使用SDS法提取DNA中SDS是什么作用?
堵龚岩15619865007 ______ 并远远超越其原来的电荷, 从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除. 与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散,形状趋向—致.多肽与SDS结合的量几乎总成正比而与其序列无关. 所以各种SDS蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异,就反映出分子量的差异. 在此条件下,样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系.
管婕义4319dna的提取方法 -
堵龚岩15619865007 ______ 一.DNA的提取方法简介 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适当的材料提取DNA. 动植物中,小牛胸腺۰动物肝脏۰鱼类精子,植物种子的胚中...
管婕义4319如何从猪脾中提取DNA?实验方法介绍下! -
堵龚岩15619865007 ______ 操作步骤:取鲜猪脾,去脂、血,称取10g,用预冷的1*SSC溶液洗2次,剪碎.按睥:1*SSC=1; 5W/V 加入50ml预冷的1*SSC,用高速组织捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒.将匀浆液放在烧杯中, 于冰盐浴中冷却30分钟.4000转/...
管婕义4319怎样提高血液DNA提取的产率 -
堵龚岩15619865007 ______[答案] DNA的提取方法简介 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适当的材料提取DNA. 动植物中,小牛胸腺۰动物肝脏۰鱼类精子,植物种子的胚中都含有丰...
管婕义4319如何提取鱼类DNA -
堵龚岩15619865007 ______ 【步骤】 一.提取脱氧核糖核蛋白 1.杀鼠取肝3克(2—3只小鼠),15ml 0.14M NaCl,0.1M EDTA洗去血液 2.肝匀浆制备 (1)乳钵中剪碎 (2)15ml 0.14M NaCl,0.1M EDTA (3)不要用力研磨 3.离心3000rpm 10分钟,弃上清 沉淀加入0.14M ...
管婕义4319请问大家怎么提取DNA -
堵龚岩15619865007 ______ DNA存在的地方很多很多,毛发,皮肤,唾液等,里面都有.而你想要提取出DNA,那好像就得利用到仪器了吧!我是这么想的~~
管婕义4319生物实验中提取不同物种的基因组DNA的实验原理是什么? -
堵龚岩15619865007 ______ 提取不同物种的基因组DNA的实验原理 不同物种的DNA提取方法 摘要 DNA作为遗传微粒,为生物体的遗传信息复制和传递做出了巨大的贡献,而1953年J.Watson和F.Crick提出的双螺旋结构模型不仅解释了有关DNA的性质,而且也清楚地解释...
管婕义4319请教DNA提取的实用的方法 -
堵龚岩15619865007 ______ 请教DNA提取的实用的方法 这个很难说,尿液里只有白细胞能提出DNA,如果这个人的尿液里含有白细胞(正常人不含,或非常少,只有疾病情况下会增多).那么就可以提取DNA.但是土壤里含有很多微生物,这些微生物的DNA比起尿液里的要多很多.
管婕义4319SDS法为什么提取出dna的是黄色的 -
堵龚岩15619865007 ______[答案] 没有洗净,不过干燥后dna一般都有点黄