sdspage胶配制

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的一种常用电泳技术。PAGE有非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳（Native-PAGE）和变性聚丙烯酰氨凝胶电泳（蛋白质变性剂通常为SDS，核酸变性剂通常为尿素、甲酰胺等）。Native-PAGE过程中蛋白质能保持完整状态，并依据分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。

其中SDS（十二烷基硫酸钠）是阴离子表面活性剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，从而破坏蛋白分子间的二、三级结构。而强还原剂如β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）均能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

图1：SDS对蛋白质构象和电荷的影响

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。因此凝胶由上层的浓缩胶和下层的分离胶组成。上下两层胶的的区别在于Tris-HCl 的 pH 值和丙烯酰胺的浓度不同。

图2：聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分离示意图

上层的浓缩胶的pH为6.8，下层的分离胶的pH为8.8，上层为负极，下层为正极。浓缩胶的主要表现为浓缩效用（堆积作用），凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。分离胶的主要表现为分子筛效用。

当电泳开始后，在这个pH条件下缓冲液中的HCl的Cl-几乎全部解，Gly解离出少量的甘氨酸根离子（Gly等电点为6.0，因此仅有少数解离为负离子）。由于蛋白质分子在前处理后带负电荷，因此在电场中和Cl-及甘氨酸根离子一起向正极移动。在电场移动过程中，Cl-移动最快，蛋白质分子居中，甘氨酸根离子移动最慢，三类离子的迁移速率为Cl->蛋白质分子>甘氨酸离子。电泳开始后，Cl-泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。甘氨酸离子在电场中移动最慢，造成移动离子的缺乏，于是Cl-和甘氨酸根离子之间就形成了一个缺少离子的高压区，具有较高的电场强度。在这高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl-区域时，高电压消失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，按照电荷大小排列。但是由于目标蛋白都带有负电荷，所以位于同一的起点，这样就起到了浓缩的作用。

从上层的浓缩胶进入下层的分离胶后，胶的pH变高，Cl-完全电离从而达到正极，甘氨酸根离子的电离度增大，泳动率上升，很快就会超过所有的蛋白质分子，紧跟在Cl-后达到正极，此时低离子浓度不再存在，分离胶中形成了一个恒定的电场强度。而这时还有蛋白质分子在分离胶中进行着缓慢的移动。根据蛋白质分子受到溶液离子的影响导致pH发生变化，但因为所带电荷数的单位质量不同，所以带负电荷多的移动快，反之则慢，这就有了电荷效应。由于分离胶的孔径大小差异，从而形成了一个整体的筛网结构，对不同分子大小的蛋白质来说，通过移动时受到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，最终也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。这样就起到了分子筛作用。

图3：变性不连续PAGE系统中蛋白质和缓冲离子的迁移。A、将变性的样品蛋白质加载到孔中；B、施加电压，样品移动到凝胶中。Cl- 离子已经存在于凝胶中（领先的离子），运行速度比SDS结合的蛋白质快，并形成一个离子前。甘氨酸根离子（尾随离子）从运行缓冲液流入并在蛋白质后面形成前沿；C、在Cl- 离子和甘氨酸根离子之间产生电压梯度，将蛋白质夹在它们之间；D、蛋白质堆叠在氯离子和甘氨酸根离子前沿之间。在堆积和分解之间的界面处，丙烯酰胺的百分比增加，孔径减小。蛋白质进入溶解凝胶的运动遇到了增加的阻力； E、由于样品中的所有蛋白质的荷质比是相等的，所以较小孔径的解析凝胶开始仅基于分子量来分离蛋白质；F、单个蛋白质根据其分子量被分离成带模式。

潘恒索1208凝胶酶谱的SDS聚丙烯酰胺凝胶和western中的配制方法有什么区别? -
酆顾荔13875941731 ______ 凝胶酶谱的SDS-PAGE含0.1%明胶 配方: 分离胶 ddH2O 4.5ml 30%储备胶(0.8%甲叉+29.2%丙烯酰胺) 1.5mol/l Tris(PH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸铵 TEMED 1%明胶(1g明胶-->100ml,37°C水浴溶解)0.5ml 浓缩胶 ddH2O 30%储备胶 1mol/...

潘恒索1208求SDS - PAGE 配方 浓缩胶 4.5%和浓缩胶3%? -
酆顾荔13875941731 ______ 5ml 7.5% : H2O 2.35ml 30% 溶液 1.25ml 1.5M Tris(pH8.8) 1.3ml 10%SDS 50ul 10%APS 50ul TEMED 4ul 5ml 4% : H2O 3ml 30% 溶液 670ul 0.5M Tris(pH6.8) 1.25ml 10%SDS 50ul 10%APS 50ul TEMED 4ul

潘恒索1208在SDS - PAGE中,配胶时需加入TEMED和过硫酸铵,它的作用是什么?但将凝胶液加入在制胶器后需在其上慢慢加入一层乙醇或异丙醇或水,其目的是什么? -
酆顾荔13875941731 ______[答案] 聚丙烯酰胺(PAGE)是由丙烯酰胺聚合形成的高分子 这个聚合反应是自由基聚合,需要有引发剂产生自由基将反应引发 过硫酸铵就是引发剂,而TEMED可以催化过硫酸铵产生自由基,从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合.

潘恒索1208sds电泳上样缓冲液如何配置
酆顾荔13875941731 ______ 5*SDS-PAGE Loading Buffer的配制(10 ml) (本方案摘自《蛋白质技术手册》汪家政、范明) 组分:Tris-HCl pH6.8(60 mM);SDS (2%);溴酚兰(0.1%);甘油(25%);β-巯基乙醇(14.4 mM) 配制过程: 1. 量取1M Tris-HCl (pH6.8) 0.6 ml;...

潘恒索1208sds - page 分离胶用多少 -
酆顾荔13875941731 ______ sds-page 分离胶不同浓度的配置表如下:

潘恒索1208求二维凝胶电泳中用到的试剂和配方,拜托诸位了!
酆顾荔13875941731 ______ 操作步骤 (一)第一向等电聚焦(用自制的电泳上样缓冲液,17cm的胶条,pH 4-7) 1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解. 2. 在小管中加入0.01g DTT, Bio-Lyte 4-6、5-...

潘恒索1208做好SDS - PAGE电泳检测的关键是什么? -
酆顾荔13875941731 ______[答案] 丙烯酰胺的有效期,配胶时要混匀充分才灌胶,灌胶时候时间要够快沿边加入,液封时要轻,凝胶凝固的时间够长(分离胶凝40分钟以上,浓缩胶凝半小时以上),在凝胶的期间不要移动凝胶,上样不要溢出,电泳电压不要过高

潘恒索1208SDS - PAGE蛋白电泳固定液问题:电泳结束割胶后,有人直接考马斯亮蓝染色,也有人用固定液固定后再染色.固定液的作用是什么?配方? -
酆顾荔13875941731 ______[答案] 不用固定,染色液中乙酸就有固定的作用, 染色液配方: 甲醇:水:乙酸=4.5:4.5:1或5:4:1

潘恒索1208SDS - PAGE测定蛋白质分之量的基本原理是什么?简述一下主要步骤?同志们帮帮忙,我出200分 -
酆顾荔13875941731 ______ 原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白...

潘恒索1208SDS - PAGE配胶 -
酆顾荔13875941731 ______ SDS浓度偏低,蛋白变性不充分,带电少,泳动慢. SDS要放在室温.如果沉淀,可以稍微加热溶解再用.