sem扫描电镜元素分析

畜禽养殖污染已经成为农业面源污染的主要来源。其中，畜禽养殖废水属于ρ(SS)、ρ(CODCr)和ρ(NH4+-N)“三高”的有机废水，由于其处理成本高，处理难度大，大量未经处理的畜禽养殖废水直接排放，对农村生态和环境造成严重破坏。如何高效处理该类废水，已成为制约畜禽养殖业绿色生态发展的瓶颈。对于规模化畜禽养殖废水，目前国内外采用的成熟处理工艺主要是厌氧-好氧联合或厌氧-自然处理联合工艺，养殖废水经过厌氧发酵处理后，虽然大部分CODCr被去除，但NH4+-N只是形态发生变化，浓度仍然很高，造成了低碳高氮沼液的产生，导致C�MN严重失调，脱氮效果差。好氧工艺发展已经成熟，但其在处理沼液时由于微生物耐高ρ(NH4+-N)性能差、碳源不足而导致后续工艺流程复杂、处理成本高和脱氮效果差等实际问题，鉴于此，该研究提出基于异养硝化-好氧反硝化脱氮技术(简称“HN-AD技术”)的新型脱氮工艺。

HN-AD技术通过易培养的异养型单一菌种HN-AD菌(异养硝化-好氧反硝化菌)使得异养硝化和好氧反硝化在好氧条件下同时进行，实现CODCr、NH4+-N、NO2--N和NO3--N的同步有效去除。与现有的一些传统及新型脱氮技术相比，其具有生长速率快、培养周期短、极端环境耐受性能强、运行条件单一、运维控制简单、适应范围广、处理效率高等优点，因此更适用于养猪废水处理。但目前该技术的研究主要集中在HN-AD菌的分离筛选、鉴定及性能验证等方面，而关于该菌工程应用方面的研究却鲜见报道，同时，HN-AD菌在自然环境中数量少、功能单一以及难以在传统处理系统中富集等问题进一步限制了HN-AD技术的应用。

针对上述问题，该研究采用前期筛选出的兼具高ρ(NH4+-N)耐受性和高脱氮效率的HN-AD菌对生物转盘工艺进行生物强化，重点考察了强化污泥挂膜和菌剂挂膜两种不同生物强化方式对该工艺启动时间、碳耗、能耗及其对真实畜禽养殖废水处理效果的影响，并分别采用SEM(扫描电镜)和IlluminaMiSeq测序技术分析对比了生物膜表面微观形态和生物膜中微生物多样性的差异，以期为HN-AD技术的工程化应用提供理论及实践基础。

1、材料与方法

1.1 试验装置

如图1所示，强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器均采用相同的试验装置，反应器所用盘片(3D-RBC)由重庆川仪环境科技有限公司提供，反应器池体由厚度5mm的有机玻璃构成，有效体积18.5L，盘片分为4级，每级盘片直径为30cm，厚7cm，材质为聚丙烯，浸没率为40%，反应器由低速电机启动。

1.2 试验用水

如表1所示，试验用水采用自来水配置，均以无水乙酸钠为碳源，以硫酸铵为氮源，以磷酸氢二钾为磷源，同时添加微量元素以保证反应器内细菌的正常生长，每升配水添加5mL微量元素，微量元素成分为MgSO4•7H2O2g�ML，MnSO4•H2O0.1g�ML，CaCl21.5g�ML，FeSO4•7H2O0.1g�ML。

1.3 研究方法

试验过程分为3个阶段，即挂膜启动阶段、参数优化阶段、处理真实废水阶段。

第Ⅰ阶段，挂膜启动阶段。条件控制在温度为25~30℃，盘片线速度为7.5m�Mmin，HRT(水力停留时间)为24h，ρ(DO)为3mg�ML，pH范围为7.5~8.0。菌剂挂膜方式:前1~15d为序批式运行，第1天向生物转盘反应器中接种OD600nm(表征菌液浓度的吸光度值)为1.2的HN-AD菌液18.5L，分别在第2、6、11、15天间歇补加5%有效体积菌液的方式实现挂膜，菌液ρ(NH4+-N)为500mg�ML，期间检测NH4+-N去除率及OD600nm的变化;第16~19天为连续流稳定运行，条件保持不变。强化污泥挂膜方式:向反应器中接种活性污泥18.5L，前2d进行闷曝;第3天开始改成连续流运行，并按梯度增大进水浓度，第3、9、15、23天进水ρ(NH4+-N)梯度分别为50、100、300、450mg�ML;第24~33天进行生物强化，每天接种5%有效体积HN-AD菌液，菌液OD600nm为1.2，进水ρ(NH4+-N)保持在500~600mg�ML，检测强化期间ρ(NH4+-N)变化。

第Ⅱ阶段，参数优化阶段。条件控制在温度为25~30℃，HRT为24h，pH范围为7.5~8.0。两个反应器均采用连续方式运行，探究在不同C�MN(5、8、10)、线速度(5.0、7.5、15.0m�Mmin)参数下该工艺的处理效果。

第Ⅲ阶段，处理真实废水阶段。条件控制在温度为25~30℃，HRT为24h，ρ(DO)为4mg�ML，pH范围为7.5~8.0。对比分析二者最优工况(C�MN为10，线速度为15.0m�Mmin)下真实畜禽养殖废水的处理效果。分别选择菌剂挂膜反应器、强化污泥挂膜反应器的挂膜完成时期、运行时期在不同盘片上选取生物膜，分别标记为A、B、C、D样品，于-80℃下保存1h后提取DNA后进行微生物多样性分析，另取两个反应器挂膜后的盘片样，于-4℃下保存1h后脱水预处理，并分别进行SEM镜检。

1.4 分析项目及方法

水样经过4μm膜片过滤后，ρ(DO)采用HQ-30d便携式溶解氧测定仪测定，ρ(CODCr)采用快速消解分光光度法测定，ρ(TN)采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定，ρ(NH4+-N)采用纳氏试剂分光光度法测定，OD600nm采用紫外分光光度法测定。SEM分析先冷冻干燥做脱水预处理，由武汉铄思百检测技术有限公司进行TESCANMIRA3热场发射扫描电镜观察生物膜表面微观形态结构。DNA提取和高通量测序采用购自天根生化科技(北京)有限公司的Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit提取固定化菌液总基因组DNA。Miseq平台对16SrRNA基因高变区序列进行测序，测序区域选择V3+V4区，测序片段为468bp，测序引物为338F-806R，使用Trimmomatic、FLASH软件对Miseq测序数据进行处理获得干净数据，在Usearch软件平台中使用uparse方法将序列按照彼此相似性为97%划分为许多小组，一个小组为一个OTU(operational taxonomic units)，从而得到OTU的代表序列。然后，使用uchime检测PCR扩增中产生的嵌合体序列并从OTU中去除，再用usearch_global方法将优化序列map比对回OTU代表序列，最终得到OTU各样品序列丰度统计表。

2、结果与讨论

2.1 挂膜启动阶段脱氮效果对比分析

在挂膜阶段，主要检测项目为ρ(NH4+-N)、OD600nm，运行条件均为HRT24h、线速度7.5m�Mmin、ρ(DO)3mg�ML、pH范围7.5~8.0。不同反应器的脱氮效果如图2所示，在强化污泥挂膜的反应器〔见图2(a)〕中，污泥挂膜处理性能较低，故前期进水ρ(NH4+-N)低于100mg�ML，后期增至500mg�ML以上，与菌剂挂膜反应器中进水ρ(NH4+-N)一致，可分为两个阶段。

第1阶段(1~23d):污泥挂膜阶段。该阶段进水ρ(NH4+-N)低，为65.86mg�ML，前期(1~8d)脱氮效率可达81.11%。生物膜层逐渐加厚，后期(9~23d)将进水ρ(NH4+-N)缓慢升至400mg�ML以上，NH4+-N去除率降至69.24%。

第2阶段(24~33d):生物强化运行阶段。利用HN-AD菌对其进行强化，在第24天对反应器每天接种5%有效体积的菌液，OD600nm为1.2，当进水ρ(NH4+-N)升至500mg�ML以上时，NH4+-N的去除率可达73.10%。

菌剂挂膜的反应器〔见图2(b)〕，在挂膜期间进水ρ(NH4+-N)为500mg�ML左右，可以分为两个阶段。

第1阶段(1~15d)，菌剂挂膜阶段。前期(1~6d)ρ(NH4+-N)下降较快，去除率达85.89%。反应器中菌液OD600nm值快速减小。后期(7~15d)生物膜厚度逐渐增加，NH4+-N去除率在90%以上。此时生物转盘上明显附着一层黄色的生物膜，同时镜检发现生物膜表面存在很多杆状和球形状原生动物。

第2阶段(16~19d):稳定运行阶段。进水ρ(NH4+-N)在500mg�ML以上时，去除率为94.37%。

综上，菌剂挂膜反应器启动所需时间为19d，强化污泥挂膜反应器启动所需时间为33d，与冯迪等结论相似，前者较后者时间缩短1�M3左右，可能是HN-AD菌因其高耐受性的特点，较普通微生物更易富集、生长速度更快。污泥挂膜反应器在前期的脱氮效果差，强化后的脱氮效果明显提高，但仍低于菌剂挂膜反应器，可能是强化污泥挂膜的挂膜方式富集了部分HN-AD菌，因此效果得以提升，但相较而言，菌剂挂膜所形成的生物膜中HN-AD功能菌富集程度更高，因此脱氮效果更好。

2.2 参数优化阶段处理效果对比分析

2.2.1 不同线速度对有机物去除及脱氮性能的影响

不同线速度下两个反应器的处理效果如图3所示，此过程C�MN为5、HRT为24h、pH范围为7.5~8.0。根据线速度大小可将此过程分为3个阶段进行对比分析。

第1阶段(线速度为5.0m�Mmin)ρ(DO)为2mg�ML，强化污泥挂膜反应器〔见图3(a)〕进水ρ(CODCr)为2106.12mg�ML，ρ(NH4+-N)为503.46mg�ML，此条件下ρ(DO)较低，盘片上的微生物生长缓慢，CODCr、NH4+-N、TN去除率较低，分别为61.14%、70.62%、63.41%。菌剂挂膜反应器〔见图3(b)〕进水ρ(CODCr)为2521.55mg�ML，ρ(NH4+-N)为547.28mg�ML，主要依靠盘片上富集的HN-AD菌对污水进行处理，CODCr、NH4+-N、TN去除率分别为70.41%、71.85%、66.00%。

第2阶段(线速度为7.5m�Mmin)ρ(DO)为3mg�ML，强化污泥挂膜反应器进水ρ(CODCr)为2339.81mg�ML，ρ(NH4+-N)为504.24mg�ML，由于线速度增大，反应器的复氧能力得以提升，CODCr、NH4+-N、TN去除率分别升至63.07%、72.27%、68.90%。菌剂挂膜反应器进水ρ(CODCr)为2494.60mg�ML，ρ(NH4+-N)为507.75mg�ML，HN-AD菌在好氧条件下优势更加显著，CODCr、NH4+-N去除率分别升至73.80%、77.63%，TN去除率基本未变。

第3阶段(线速度为15.0m�Mmin)ρ(DO)为4mg�ML，强化污泥挂膜反应器进水ρ(CODCr)为2356.93mg�ML，ρ(NH4+-N)为529.56mg�ML，反应器在此线速度下对污水的处理效果依旧呈上升趋势，CODCr、NH4+-N去除率分别升至65.52%、79.75%，TN去除率为61.47%。菌剂挂膜反应器进水ρ(CODCr)为2556.64mg�ML，ρ(NH4+-N)为500.34mg�ML，线速度增大对HN-AD菌的去污能力提升显著，此时CODCr、NH4+-N去除率分别为83.71%、71.50%，TN去除率与上一阶段相差不大，为65.16%。

由图3可见，强化污泥挂膜反应器在线速度为7.5m�Mmin时的处理效果与菌剂挂膜反应器在线速度为5.0m�Mmin时的脱氮效果大致相当，但后者在工程应用时转速较前者降低了33.33%，更节省能耗，运维成本更低，可能是后者采用的生物强化方式富集的HN-AD菌更多，在参数优化阶段富集程度依旧保持稳定，因而效果更好。随着线速度增大，强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器去污能力增强，菌剂挂膜反应器特别显著，但TN去除率一直变化不大，可能是线速度对NO3--N去除率影响较小。线速度与DO的传质速率有关，结果表明强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器的处理效果随线速度增大均呈现上升趋势，可能是ρ(DO)升高的原因，也可以说明在线速度为15.0m�Mmin时反应器中的ρ(DO)仍未达到过饱和状态，继续提升转速可能会加强反应器的NH4+-N去除效果，但运行成本也会增加。线速度为15.0m�Mmin时，强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器的处理效果均最佳，与李芳等结论相似。

2.2.2 不同C�MN对有机物去除及脱氮性能的影响

不同C�MN下强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器的处理效果如图4所示，该过程在一定的进水有机负荷范围〔以ρ(CODCr)计，≤0.25kg�M(m3•d)〕内，提高ρ(CODCr)可以提升微生物的活性和利用率，进而增强处理效果。在该阶段可以逐渐提升C�MN，保持HRT为24h，线速度为15.0m�Mmin，ρ(DO)为4mg�ML，pH范围为7.5~8.0，可分为3个阶段进行对比分析。

第1阶段C�MN为5，强化污泥挂膜反应器〔见图4(a)〕进水ρ(CODCr)为2562.26mg�ML，ρ(NH4+-N)为520.39mg�ML，此阶段进水ρ(CODCr)较线速度优化第3阶段略高，CODCr去除率降至50.24%，NH4+-N、TN去除率基本未变，分别为74.54%、62.42%。菌剂挂膜反应器〔见图4(b)〕在此阶段进水ρ(CODCr)为2647.54mg�ML，ρ(NH4+-N)为496.73mg�ML，菌剂挂膜反应器较强化污泥挂膜反应器处理效果更稳定，CODCr、NH4+-N、TN去除率分别为86.11%、70.51%、66.91%。

第2阶段C�MN为8，强化污泥挂膜反应器进水ρ(CODCr)为4095.61mg�ML，ρ(NH4+-N)为556.09mg�ML，随有机物浓度增大，处理效果有所上升，CODCr、NH4+-N、TN去除率分别为58.13%、74.70%、60.85%。菌剂挂膜反应器在此阶段进水ρ(CODCr)升至4188.33mg�ML，ρ(NH4+-N)为518.30mg�ML，总的处理效果比上一阶段优势明显，CODCr去除率略有降低，为77.28%，NH4+-N、TN去除率分别升至91.06%、73.28%。

第3阶段C�MN为10，强化污泥挂膜反应器进水ρ(CODCr)为5113.21mg�ML，ρ(NH4+-N)为564.88mg�ML，CODCr、NH4+-N、TN去除率分别升至63.13%、78.41%、59.93%。菌剂挂膜反应器在此阶段进水ρ(CODCr)升至5146.59mg�ML，ρ(NH4+-N)为528.75mg�ML，CODCr和NH4+-N去除率均较上一阶段有所升高，分别达84.75%、95.25%，TN去除率变化不大。

由图4可见，强化污泥挂膜反应器在C�MN为10时的处理效果与菌剂挂膜反应器在C�MN为5时的处理效果大致相同，但后者较前者碳源消耗降低48.22%，更节省碳耗，且在C�MN优化的各阶段，菌剂挂膜反应器脱氮效果均优于强化污泥挂膜反应器，推测是前者挂膜方式富集的HN-AD菌更多，经线速度优化后，富集程度依旧更高;C�MN为5时，进水ρ(CODCr)变化使得强化污泥挂膜反应器的CODCr去除效果较线速度优化第3阶段有所降低，而菌剂挂膜反应器未有显著变化，说明后者稳定性更好，HN-AD菌更耐受冲击负荷;前者在C�MN为8时，CODCr去除率较第1阶段和第3阶段分别低10.25%、8.81%，可能是在C�MN为5时HN-AD功能菌较少，与其他微生物菌群共同作用，C�MN为8时受到高浓度有机负荷冲击，耐受性低的微生物菌群受到抑制，导致其去除率降低，HN-AD功能菌耐高C�MN特性优势显著，随着C�MN增大，富集程度增大，因而C�MN为10时去除率上升;此外，随着C�MN的升高，强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器的CODCr、NH4+-N、TN去除率大致都随之升高，可见C�MN为10即为最佳运行条件，与何环等结论相似。

2.3 处理真实废水阶段效果对比分析

参数优化后，在线速度为15.0m�Mmin，C�MN为10，HRT为24h，ρ(DO)为4mg�ML下，探究强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器对真实畜禽养殖废水的处理效果(见表2)。由表2可见:菌剂挂膜的反应器真实废水进水ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)分别为7773.08、647.88和790.26mg�ML，该反应器对真实废水CODCr、NH4+-N、TN的平均去除率分别为68.95%、87.24%和79.45%;强化污泥挂膜反应器真实废水进水ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)分别为7437.92、695.02、719.18mg�ML，该反应器对真实废水CODCr、NH4+-N、TN的平均去除率分别为64.37%、68.71%、61.52%。经过对比可见:菌剂挂膜反应器较强化污泥挂膜反应器CODCr、NH4+-N、TN去除率分别高出7.11%、26.97%、29.14%，前者去除效果更好;强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器CODCr去除率均低于70%，处理效果低于模拟废水试验，推测是真实废水有机负荷更高，且存在较多的SS、抗生素等成分，使得HN-AD菌生长受到影响，导致CODCr去除率降低。

2.4 不同挂膜方式的反应器微生物群落结构变化对比分析

挂膜完成时期以及稳定运行时期的微生物群落结构变化如图5所示。由图5可见，强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器内的HN-AD脱氮优势菌属的种类及相对丰度均发生了变化。菌剂挂膜的反应器中，挂膜时期的Flavobacterium、Acinetobacter(不动杆菌属)相对丰度从19.18%、11.36%分别变为0.27%、0.14%，相对丰度均快速降低;运行后，Diaphorobacter、Comamonas的相对丰度从0.06%、0.09%分别增至2.16%、2.99%。该反应器中的优势菌群由Acinetobacter变为Comamonas，以进行异养硝化好氧反硝化。

污泥挂膜的反应器中，挂膜时期的Hydrogenophaga(嗜氢菌属)、Diaphorobacter相对丰度从1.08%、0.65%分别降至0.70%、0.55%。对该反应器进行生物强化后，Flavobacterium、Rhizobium的相对丰度也迅速降低，Acinetobacter、Comamonas的相对丰度分别迅速增至18.56%、0.29%。该反应器接种菌剂前后的菌群不仅丰度发生了变化，其优势种群也发生了变化，变化为Acinetobacter，并出现了新的HN-AD功能优势菌属。对比二者的微生物多样性可见，强化污泥挂膜和菌剂挂膜反应器中Hydrogenophaga和Flavobacterium均呈现丰度降低的趋势，可能是该菌属对高ρ(NH4+-N)耐受性低，对脱氮过程起到的作用小。虽然强化污泥挂膜的反应器中Acinetobacter相对丰度远高于菌剂挂膜反应器，但菌剂挂膜反应器中的Comamonas是强化污泥挂膜反应器的10倍左右，结合处理效果对比分析，可以推测Comamonas是在异养硝化好氧反硝化过程中发挥关键作用的菌属。

2.5 不同挂膜方式的反应器SEM表征分析

图6为生物盘片序批式接种挂膜的SEM对比结果。在盘片挂膜前〔见图6(a)〕的SEM图片中可以观察到生物盘片表面为规则的波纹状，这种结构有利于增加盘片表面积、增加生物附着量。在强化污泥挂膜后〔见图6(b)〕，盘片表面附着了大量的污泥，生物膜呈三维交织状，膜层较厚。在菌剂挂膜后〔见图6(c)〕，盘片表面可形成较为平滑的生物膜，膜层较薄，呈簇团状的球状菌群紧密附着在生物膜上，其菌剂附着量较强化污泥挂膜更多。结合微生物多样性分析可以得出，菌剂挂膜的盘片吸附的HN-AD优势菌以Comamonas、Diaphorobacter为主，强化污泥挂膜盘片表面附着的球状菌为HN-AD优势菌，以Comamonas、Acinetobacter为主;对比生物膜可以看出，膜层较薄时菌剂吸附更多、传质速率更高、处理效果更好。

3、结论

a)菌剂挂膜启动所需的时间(19d)明显少于强化污泥挂膜(33d)。

b)参数优化阶段，在C�MN为10、线速度为15.0m�Mmin时的去除效果最好;同等处理效果下，菌剂挂膜反应器的碳耗、能耗较强化污泥挂膜反应器分别少48.22%、33.33%。

c)真实废水处理阶段，菌剂挂膜反应器ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)的去除率分别为68.95%、87.24%和79.45%，较强化污泥挂膜反应器分别高出7.11%、26.97%、29.14%。

d)菌剂挂膜反应器中Comamonas是强化污泥挂膜反应器的10倍左右，结合处理效果对比分析可以推测，Comamonas是在异养硝化好氧反硝化过程中发挥关键作用的菌属。

e)强化污泥挂膜生物转盘上附着一层较厚的网状结构生物膜，HN-AD菌少;菌剂挂膜生物转盘上附着的生物膜虽然更薄，但传质速率更高，HN-AD菌富集程度更好，处理效果也更好。

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别沿祁3696扫描电镜与原子力显微镜
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