takara+t4连接酶连接体系

沈永府3534如何增加t4 dna连接酶的连接效率 -
离新柳17680698670 ______ 加入PEG8000,反应体系终浓度5%

沈永府3534DNA连接酶只有一种吗,可以连接任何DNA吗 -
离新柳17680698670 ______ DNA连接酶有很多种,分为两大类,一为利用ATP能量促使两个核苷酸链形成磷酸二酯键的ATP依赖性DNA连接酶.另一种是利用NAD+能量促使两个核苷酸链形成磷酸二酯键的NAD+依赖性DNA连接酶.这两种酶又有很多同工酶.一般的连接酶所连接的两条链必须是与同一条互补链配对结合的,而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键. 而T4DNA连接酶则可以连接平末端.

沈永府3534求各公司内酶切优缺点,如Takara,NEB,Fermentas等.谢谢 -
离新柳17680698670 ______ 看你要做啥了,像是对内切效果要求比较高的最好用NEB的~保真性好,一般不怎么会产生星号活性.比如AFLP,MSAP等,但是酶切时间较长. Fermentas的优点是时间短,效率高,是快速内切酶,但是感觉还是效率没有NEB的好. Takara的在两者之间,效果一般,我们实验室一般不用的.

沈永府3534我问下takara 的puc18载体的目的片段到底是连载什么位置?说明书上也没有, -
离新柳17680698670 ______ 目的片段都是连在多克隆位点之间的,载体和外源都用相同的限制性内切酶酶切,就可以将外源通过连接酶连接上载体.酶切验证时看你设计引物扩增外源片段的酶切位点是什么,就用什么酶切,不过如果外源及载体内部都没有(除MCS)的酶而且在载体酶切酶位点外侧的酶切位点也是可以用来验证的.

沈永府3534为什么酶切实验要求加样迅速,要在冰上进行操作? -
离新柳17680698670 ______ 连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min,马上置于冰上冷却,再加入buffer和ligase. 双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,我一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够.应用大...

沈永府3534PCR中的taq酶有没有5'→3'外切活性 -
离新柳17680698670 ______ 一般的taq酶没有5'-3'的外切活性,不过现在有一些酶,比如TAKARA的Ex-Taq是有5'-3'的外切活性的,主要是为了减少错配提高保真率. 再好的就是PrimerStar了. 另外还有pfu酶,最近用的比较多,保真性介于Ex和PS之间,还是挺好用的,就是扩增效率没.

沈永府3534PCR后出现非特异性扩增是什么原因? -
离新柳17680698670 ______ PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失. 假阴性,不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原...

沈永府3534双酶切的20μL反应体系和反应时间如何确定?最好是说明原理.所用的酶都是Takara公司的 -
离新柳17680698670 ______ 模板DNA 几百ng-几ug,区别不大 酶1 0.5ul 酶2 0.5ul buffer 去Takara产品目录查双酶切buffer表,按照那个倍数加,有时候需要BSA 水补足 20ul 30或37度,1-5小时都可以.有个别酶需要55度. 注意,酶别加多了,甘油浓度过高影响酶的活性.反应体系中甘油浓度要小于1%,而酶是储存在50%甘油中.

沈永府3534dna连接酶的作用特点有哪些?了解这些特点有何使用价值 -
离新柳17680698670 ______ DNA连接酶分为两类:常用的E·coliDNA连接酶(大肠杆菌中分离)和T4DNA 连接酶(T4噬菌体中分离的)

沈永府3534Takara的NheI 和BamHI双酶切体系表中没有双酶切缓冲体系应该如何选用缓冲液呢?只能进行分步酶切吗? -
离新柳17680698670 ______[答案] 1、如果你用的是Takara的酶,应该就只能分步了,而且BamHI还是30度反应,虽然也可以在37度切,但如果是分步切的话还是用30度吧. 2、为什么不用NEB的酶呢?可以用buffer1或2同时切(好像是,你需要自己再确认下),而且NEB的这两种酶...