te缓冲液
[实验原理]
在 EDTA 和 SDS 等去污剂存在下,用蛋白酶 K 消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳 动构基因组 DNA,用此方法得到的 DNA 长度为 100-150 kb,适用于 L 嘴菌体构建基因组 文库和 Southern 分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组 DNA 的原理和步骤,以及相对分子质量较大的 DNA的 琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1.台式离心机
2.玻璃匀浆器
3.高压灭菌锅
4.恒温水浴
(二)材料
1.1.5mL 微量离心管
2.微量取样器和吸头
3.无菌过滤器(一次性)
4.10 mL 注射器
5.鼠肝
6.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
7.十二烷基硫酸钠(SDS)
8.乙二胺四乙酸(EDTA)
9.蛋白酶 K
10.RNA 酶
11.DNA 相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物
(三)试剂
1、1.5 mol/L\tNaCl
2、0.5 mol/L Tris·HCI\tpH8.0
3.0.5 mol/L EDTA\t\tpH8.0
4.3 mol/L NaAc\tpH5.2 以上均高压灭菌。
5.蛋白酶 K 10mg/mL 配好后用一次性过滤器过滤,-20 保存(教师配制)
6.组织匀浆液 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/ LEDTA(pH8.0)
7.酶解液 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL 蛋白酶 K,1%SDS
8.无 DNA 酵的 RNA 酶 : 将胰 RNA 酶溶解于 10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L NaCl 溶液中,浓度 l0mg/mL,于 100℃水浴处理 15min,以降解 DNA 酶,缓慢冷 却到室温,-20℃保存
9.TE 缓冲液 :10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)
10.平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1<体积比)
11.氧仿:异戊醇=24:l(体积比)
12.5xTBE 5.4gTris,2.75g 硼酸 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到 100mL;
13.6x 上样缓冲液 o.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液
14.λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP)21 227,5148,4 973,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125
[实验步骤]
本实验在无液氮的条件下,铡备鼠肝 DNA,与有液氮条件下相比,产量和质量都有所下 降。整个操作过程中,应尽量避免 DNA 酶的污染,特 g4 注童动作温和,减少对 DNA 的 机械捌伤。
1、取 0.2g 鼠肝,用冰冷的生理盐水洗 3 次,然后置于 2.0mL 匀浆掖中,用玻璃匀浆器匀 浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切匆将细胞破碎,可镜检观察)。
2、将组织细胞移至 1.5ml 离心管中,50000rpm 离心 30-60sec,(尽可能在低温下操作), 弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入 1 倍于细胞体积的匀浆液洗一次。
3、沉淀加 0.8mL 无菌水迅速吹散,分两管,再加 0.4mL 酵解液,翻转混匀(动作一定要 轻)55℃水浴处理 12-18 h;
4、沉淀加 RNase 至终浓度 200µg/mL,37℃水浴 1 h;
5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次,(慢慢旋转混勾,倾斜使两相接触面增大)。4℃、 10min、10000rpm 离心;
6、有时如果 DNA 含量过高,水相在下层,实验时应注意观察。用扩口吸头移出含 DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等体积氧仿/异戊醇,4℃、10 000rrpm 离心 10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重复 1.6 操作)。
7、用扩口吸头小心吸出上层含 DNA 的水相,加 1/10 体积的 NaAc,小心混匀(要充分), 再向每管中加入 2.5 倍体积的无水乙醇,-20 过夜。
8、12 000rpm 离心 19min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000rpm 离心 15min 室握温干燥(不要大干,否则 DNA 不易溶解),加入适量 TE 缓冲液,存放于 4℃,轻摇溶解过夜,即可得 到实验动物基因组 DNA。
9、电泳鉴定 DNA,由于基因组 DNA 相对分子质量较大,用 0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定, 先在底部锦一层 1%的支持胶,凝固后再铺上一层 0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(枚子不能瑾 到的支持胶)。取 1.5µL 溶解的 DNA、1µL 上样缓冲液和 35µl 无菌水混匀后小心上样(可在 另一孔加 DNA 相对分于质量标准),观察基因组 DNA 大小,用溴化乙锭染色观察结果。
[注意事项]
1、操作过程尽量在低温下进行,避免 DNA 降解。
2、琼脂糖凝胶脆弱,应小心操作。
3、提取得到的基因组 DNA 应为单一条带,DNA 降解可形成弥散带型。
查冉榕2070TE缓冲溶液(10mmol/L Tris - HCl, 1mmol/L EDTA,PH 8.0)这个试剂怎么配啊????
太刻郎15216507214 ______ 取用1ml体积1mol/L 的Tris-HCl(pH7.4-8.0)缓冲液,再加入200μl体积的0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶液,在100ml的容量瓶中用高纯水定容即可~ 【平の楽^.^小平平】
查冉榕2070为什么要用低盐 高盐 licl te缓冲液 -
太刻郎15216507214 ______ 因为DNA提取最后加入TE缓冲液之前,DNA溶在柱子上的硅质膜上,膜处于干燥状态,而加入TE缓冲液后,要使膜充分湿润,从而尽量使更多的DNA溶解到TE缓冲液中,再离心才能提取到尽可能多的DNA. 如果加入TE缓冲液直接离心
查冉榕2070天根 - 天根粪便DNA提取试剂盒里面的试剂的作用是什么?
太刻郎15216507214 ______ 缓冲液GA:裂解细胞,为蛋白酶K提供适合的反应体系. 缓冲液GB:可能含有蛋白变性剂,暴露DNA. 缓冲液GD:主要作用是去除残留的蛋白质. 漂洗液PW:洗脱脂类、蛋白及盐类等杂质. TE缓冲液:主要用于溶解DNA,能稳定储存DNA.
查冉榕2070RNA保存时用到的TE是什么? -
太刻郎15216507214 ______ TE是就是Tris-EDTA缓冲液.可保护核酸碱基.
查冉榕2070滤纸上质粒如何提取,实验要用,比如说像用多少TE缓冲液,时间,还要不要离心啊,还有的是我见有的人是说要在泡四个小时,我真心不知道哪个是真确的. -
太刻郎15216507214 ______[答案] 质粒可以用灭菌的DDH2O或者TE buffer溶解,一般溶解四小时应该足够了,不放心的话可以4度过夜,可以用圆圈的四分之一或者二分之一溶解在50-100ul上述溶液中,4度过夜后,10000g离心一分钟,取上清10ul转化至DH5α细胞内即可.
查冉榕2070tris缓冲液如何配置? -
太刻郎15216507214 ______ Tris-HCl缓冲液的配制方法:Tris:三羟甲基氨基甲烷 三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,一般简称为Tris)是一种有机化合物,其分子式为(HOCH2)3CNH2.Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的...
查冉榕2070omega细菌DNA提取试剂盒中的TE buffer是什么? -
太刻郎15216507214 ______ 是Tris-Hcl和EDTA的混合液 可以增加DNA的稳定性 你可以自己配制,配方如下: TE缓冲液配方(10*,PH8.0) 100mmol/L的Tris-Hcl(PH值8.0)和10mmol/L的EDTA(PH值8.0)混合分装后高压灭菌,室温保存.
查冉榕2070DNA提取常规溶液中,浸泡缓冲液,STE缓冲液,TE缓冲液,蛋白酶K,EDTA,SDS的作用还可以简单的说说DNA提取内容不 -
太刻郎15216507214 ______[答案] 你用的试剂盒吗? 缓冲是调ph的,蛋白酶分解蛋白,EDTA是螯合二价离子,失活DNA酶,SDS是裂解细胞,变性蛋白用的,TE缓冲和STE缓冲大概是试剂盒里面的,改变DNA与硅胶亲和力的.这个名字不同的试剂盒是不同的,TAKARA的就是SE,...
查冉榕2070测定巯基的tris - gly溶液怎么配制 -
太刻郎15216507214 ______ Tris-HCl缓冲液的配制方法: Tris:三羟甲基氨基甲烷 三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,一般简称为Tris)是一种有机化合物,其分子式为(HOCH2)3CNH2.Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液...