tris-hcl缓冲液6.8怎么配

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的一种常用电泳技术。PAGE有非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳（Native-PAGE）和变性聚丙烯酰氨凝胶电泳（蛋白质变性剂通常为SDS，核酸变性剂通常为尿素、甲酰胺等）。Native-PAGE过程中蛋白质能保持完整状态，并依据分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。

其中SDS（十二烷基硫酸钠）是阴离子表面活性剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，从而破坏蛋白分子间的二、三级结构。而强还原剂如β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）均能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

图1：SDS对蛋白质构象和电荷的影响

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。因此凝胶由上层的浓缩胶和下层的分离胶组成。上下两层胶的的区别在于Tris-HCl 的 pH 值和丙烯酰胺的浓度不同。

图2：聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分离示意图

上层的浓缩胶的pH为6.8，下层的分离胶的pH为8.8，上层为负极，下层为正极。浓缩胶的主要表现为浓缩效用（堆积作用），凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。分离胶的主要表现为分子筛效用。

当电泳开始后，在这个pH条件下缓冲液中的HCl的Cl-几乎全部解，Gly解离出少量的甘氨酸根离子（Gly等电点为6.0，因此仅有少数解离为负离子）。由于蛋白质分子在前处理后带负电荷，因此在电场中和Cl-及甘氨酸根离子一起向正极移动。在电场移动过程中，Cl-移动最快，蛋白质分子居中，甘氨酸根离子移动最慢，三类离子的迁移速率为Cl->蛋白质分子>甘氨酸离子。电泳开始后，Cl-泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。甘氨酸离子在电场中移动最慢，造成移动离子的缺乏，于是Cl-和甘氨酸根离子之间就形成了一个缺少离子的高压区，具有较高的电场强度。在这高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl-区域时，高电压消失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，按照电荷大小排列。但是由于目标蛋白都带有负电荷，所以位于同一的起点，这样就起到了浓缩的作用。

从上层的浓缩胶进入下层的分离胶后，胶的pH变高，Cl-完全电离从而达到正极，甘氨酸根离子的电离度增大，泳动率上升，很快就会超过所有的蛋白质分子，紧跟在Cl-后达到正极，此时低离子浓度不再存在，分离胶中形成了一个恒定的电场强度。而这时还有蛋白质分子在分离胶中进行着缓慢的移动。根据蛋白质分子受到溶液离子的影响导致pH发生变化，但因为所带电荷数的单位质量不同，所以带负电荷多的移动快，反之则慢，这就有了电荷效应。由于分离胶的孔径大小差异，从而形成了一个整体的筛网结构，对不同分子大小的蛋白质来说，通过移动时受到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，最终也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。这样就起到了分子筛作用。

图3：变性不连续PAGE系统中蛋白质和缓冲离子的迁移。A、将变性的样品蛋白质加载到孔中；B、施加电压，样品移动到凝胶中。Cl- 离子已经存在于凝胶中（领先的离子），运行速度比SDS结合的蛋白质快，并形成一个离子前。甘氨酸根离子（尾随离子）从运行缓冲液流入并在蛋白质后面形成前沿；C、在Cl- 离子和甘氨酸根离子之间产生电压梯度，将蛋白质夹在它们之间；D、蛋白质堆叠在氯离子和甘氨酸根离子前沿之间。在堆积和分解之间的界面处，丙烯酰胺的百分比增加，孔径减小。蛋白质进入溶解凝胶的运动遇到了增加的阻力； E、由于样品中的所有蛋白质的荷质比是相等的，所以较小孔径的解析凝胶开始仅基于分子量来分离蛋白质；F、单个蛋白质根据其分子量被分离成带模式。

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