western电泳电流多少

凤贡庞2912western blot这个技术为什么不同人做出来的结果会相差那么远呢? -
唐勉研13658035658 ______ 与实验条件和每个人的实验习惯有关系.在操作规范,实验者素质较高的实验室western的结果可重复度还是很高的. 但是western毕竟是一个定性或半定量的实验,过程繁琐,中间的很多步骤很容易造成误差.从取样,到电泳上样,转膜,封闭,加抗体,显影,每一步都会有误差.

凤贡庞2912Western blot 内参跑不齐怎么调整 -
唐勉研13658035658 ______ 第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,虽然是持家基因,本人觉得不同细菌可能表达量不一样,造成信号强弱不一样.可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH. 第二,内参跑不齐.一般是跑胶...

凤贡庞2912做western显影出现很多杂带是什么原因 -
唐勉研13658035658 ______ 有很多种原因,举例如下: 1.抗体浓度过高 2.SDS造成非特异性结合 3. 二抗试剂的非特异结合 4.一抗特异性差 推荐采用已经经过厂家验证的WB应用抗体,有图有真相像义翘的WB抗体一样,用起来才放心. 另,最好放上自己的实验条件和结果图片,可以让大家帮你分析分析.

凤贡庞2912WESTERN BLOT 中NACL过多对蛋白有影响吗?是否会导致没有条带出现?? -
唐勉研13658035658 ______ NACL过多不会造成蛋白性变(就算一时变性,但在低盐时会复性).但NACL过多会造成电泳条带变型.跑得慢,难看. 但理论上讲不会导致没有条带出现. 可以在跑完胶时染一下胶看一下. WESTERN BLOT没有条带出现的原因很多的,如DAB显色可能是灵敏度达不到.ECL显色可能是显色系统出问题,可以做一下内参看看.

凤贡庞2912actin检测反转录产物时 跑多长时间电泳?多大电压 谢谢 -
唐勉研13658035658 ______ 如果是蛋白,跑western,分子量40KD,普通SDS胶100V,一个小时足够.如果是跑PCR,那要看你的产物有多大.通常PCR产物几百bp, 100V 跑15分钟就可以了.

凤贡庞2912western blot电泳时每孔的上样体积可以不等吗 -
唐勉研13658035658 ______ 最好一样,如果实在不一样,也尽量不要相差两倍体积,超过两倍体积,就要用PBS补充缺少的体积,否则体积不一样,起始电压会有影响

凤贡庞2912做Western时如何判断蛋白是否降解? -
唐勉研13658035658 ______ 恩..如果蛋白样品比较多...可以将电泳后的胶用考马斯亮蓝染色观察染色后胶上的条带形状以判断蛋白降解情况.如果蛋白样品比较稀少也可以经电泳、转膜后将胶进行考马斯亮蓝染...

凤贡庞2912关于western问题我的电泳条带总是两头翘,各种可能的原因都?
唐勉研13658035658 ______ 可以调低电压,避免跑胶过快,凝胶过热,看有没有改善.有时候缓冲液反复使用太多次也会出现这种情况,应该及时更换缓冲液.

凤贡庞2912为什么western blot 及southern blot电泳后都要转膜?
唐勉研13658035658 ______ western southern其实都是要做标记的.因为样品是很多蛋白(western)或DNA(southern)的混合物,而我们只要看其中的目的条带,所以必须用特定的方法把目的条带标记出来,而其他的条带不显示(比如western的抗原抗体标记,southern的放射性自显影).这种标记必须在膜上进行,不能直接在胶上进行,所以电泳后必须转膜. 如果不转膜,也可以直接把胶染色,把所有的条带都染出来(比如考染,银染).但这种实验就不叫western了.western、southern都特指标记法.

凤贡庞2912western杂交出现分子量大于和小于预期蛋白的条带'原因是什么啊'? -
唐勉研13658035658 ______ 实际上来说,Western并不能对蛋白质的分子量进行测定,它只是利用一抗二抗显色的步骤从凝胶上定性找到某一蛋白质.所以分子量大小还是在于电泳的过程. 首先,从电泳的原理上讲,它通过带电基团在电场中的移动来测定分子量,蛋白质的构象(空间形态)对这个影响很大,球蛋白就会比线形蛋白显的分子量小.而且marker同样有这个问题. 另外,对于western来说,多数都是从生物体中(细胞裂解液)做全蛋白电泳,然后特异性检测某一蛋白的存在,正因如此,蛋白质的一级结构就显的很重要了,毕竟你的预期蛋白是唯一的,而生物表达的蛋白可能就会存在或多或少的差异,分子量自然也就不会完全匹配预期.