westernblot原理

乙酰化检测是一项关键的生物化学分析，用于研究蛋白质和其他生物分子的乙酰化状态。乙酰化是指一个乙酰基（-COCH₃）团附加到分子上，这通常发生在蛋白质的赖氨酸残基上。这种翻译后修饰对于调节蛋白质的功能、结构和相互作用至关重要。本期介绍一些主要的乙酰化检测方法及其详细说明：

图1.乙酰化修饰研究路线

一、免疫印迹分析 (Western Blot):

原理: 蛋白质通过SDS-PAGE电泳分离，然后转移到膜上。使用针对乙酰化位点的特异性抗体进行检测。
步骤: 蛋白质提取、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育（首抗和次抗）、信号检测。
优点: 能够特异性检测目标蛋白的乙酰化状态；可以通过条带强度估计乙酰化程度。
缺点: 对蛋白量和抗体质量要求较高，且无法提供乙酰化位点的确切位置。

二、免疫沉淀 (Immunoprecipitation, IP):

原理: 使用特异性抗体捕获乙酰化蛋白，然后进行西方印迹或质谱分析。
步骤: 细胞裂解、抗体孵育、免疫复合物沉淀、洗涤、蛋白质解离和分析。
优点: 可以富集特定乙酰化蛋白，提高检测灵敏度。
缺点: 抗体的特异性和亲和力至关重要，可能会有非特异性结合。

三、质谱分析 (Mass Spectrometry, MS):

原理: 利用质谱仪精确鉴定乙酰化位点，并定量分析乙酰化程度。
步骤: 蛋白质消化、肽段分离、质谱检测、数据分析。
优点: 提供精确的乙酰化位点信息，定量精度高。
缺点: 技术要求高，成本相对较高。

四、酶联免疫吸附测定 (ELISA):

原理: 使用特异性抗体检测和定量特定蛋白质的乙酰化水平。
步骤: 抗体包被、样品添加、抗体结合、底物添加、颜色发展和读数。
优点: 操作简单，适合批量检测和快速筛选。
缺点: 灵敏度和特异性依赖于抗体质量。

五、荧光标记:

原理: 使用荧光标记的乙酰化特异性抗体，通过荧光显微镜观察乙酰化蛋白的分布。
步骤: 样品固定、抗体孵育、荧光标记、显微镜观察。
优点: 可以直观观察蛋白质在细胞中的位置和分布。
缺点: 无法提供定量数据，且对荧光标记和显微镜设备有一定要求。

以上每种方法都有其独特的应用领域和局限性。选择合适的方法取决于实验的具体目的、可用设备、样品类型以及所需的数据类型。在实施这些技术时，应严格控制实验条件和数据分析，以确保结果的准确性和重复性。

吴杭雷4668在western blotting 抗原和抗体的分子量一定是一样的吗 -
仲奚纪13090119085 ______ 理论上Western blot的抗体是可以用来免疫沉淀的 但是免疫沉淀是在相对较弱的变形条件下进行抗原和抗体的识别,这时候蛋白质还保留着大部分的三级结构.如果用单抗IP有可能不能识别起有效的抗原决定簇位点 而Western blot则是在变性条件下进行的,抗原决定簇都已经暴露,所以比较容易被单抗所识别 所以用Western blot的抗体来做免疫沉淀有较大失败的可能性

吴杭雷4668western blot整张膜都发光怎么回事 -
仲奚纪13090119085 ______ 曝光时间太长,抗体浓度过高,洗涤不充分,封闭不充分,发光试剂不好都有可能造成整张膜都发光.跟蛋白样品的蛋白量应该是没有关系的.

吴杭雷4668western blot转膜不完全怎么办? -
仲奚纪13090119085 ______ 个人建议时间不要再长了,再长蛋白有可能变性造成后续实验无法进行.我原来遇到这类问题是用以下几种方法尝试解决的,你也可以尝试一下 (1)检查一下你的三明治结构夹的怎么样,尤其是膜及滤纸的边缘是不是有短接的地方,这个是最...

吴杭雷4668非还原状态的western blot 应该怎样做 -
仲奚纪13090119085 ______ 就是所有的缓冲液,上样缓冲液,配胶的缓冲液里面不加还原剂.

吴杭雷4668Southern blot和原位杂交的区别 -
仲奚纪13090119085 ______ 可以在原来的基因两端寻找两个酶切问点,通过多全基因组酶切的片段进行southern杂交.全基因族酶切,在不同长度的片段利用探针检测,如果出现2个或多个点,说明是多拷贝,如果是单一点,则说明是单拷贝.外源DNA和原基因都要设计探针,只有外源DNA的探针出现杂交则说明是原位敲除.

吴杭雷4668请问如何检测RAS、MAPK、p38、p21? -
仲奚纪13090119085 ______ 博凌科为解答:检测信号通路现在用的比较多的方法应该是Western blot,它是测细胞中的蛋白含量(半定量)的最好方法了,免疫组化检测是定性的!如果时间充裕的话,你可以两种方法都可以做的.RAS:Ras蛋白是细胞内的一种小分子GTP结合蛋白,结合GTP时为活性形式,GDP时为失活状态,,其活性形式是磷酸化形式,所以应该用磷酸 化的RAS抗体,方法用western blot和免疫组化都行.

吴杭雷4668新生儿获得性免疫缺陷综合征有哪些表现及如何诊断? -
仲奚纪13090119085 ______ 从母婴传播所致感染的患儿,可早在出生后几个月就出现临床征象,潜伏期数月至数年不等.1.一般临床表现 有持续发热、消瘦、低出生体重、出生后体重不增、黄疸不退...

吴杭雷4668WESTERN BLOT实验中转膜时滤纸和膜的大小有什么要求?是滤纸比膜小对吧?为什么? -
仲奚纪13090119085 ______ 你的问题好多啊 1 滤纸是上下都有的 之所以小一点儿 是怕上下的滤纸边缘直接短路,相连导致电子不能从胶穿过,这样不能达到很好的转移效率 2 可以用BSA,具体多大浓度,可以参照脱脂奶粉的 3 这个检测没多大用处吧 如果非要探讨这个问题 可以拿转完的胶再去染色(考马斯亮蓝或银染) 4 显色系统 基本就是HRP催化的DAB TMB等,AP催化的(NBTBCIP,我用的是roche的),也可以用HRP,AP催化化学发光,比如GE(原来的阿马西亚)的ECL(这个系统我没用过),赛默(原来的pierce)的化学荧光(我用过这个做southern)

吴杭雷4668western blot 裂解液加多少 比例 -
仲奚纪13090119085 ______ PMSF是一种蛋白酶抑制剂,因为其在水溶液中不稳定,所以用异丙醇或无水乙醇溶解,一般在用之前现加入裂解液.因此他是裂解液中的一种成分,而不是裂解液 附: PMSF 即Phenylmethanesulfonyl fluoride,中文名为苯甲基磺酰氟.分子式...