层析柱分类

小分子药物开发的历程可分为三个阶段。第一个阶段是化合物时代。随着生理学和化学工业的兴起，药物开发主要是依靠经验从植物中提取或利用化学手段合成。典型代表是青霉素（盘尼西林）。第二阶段，仍然是化合物时代，但是随着分子生物学和细胞生物学的兴起，人们对疾病本质和机理有了更深入的认识，以此为基础针对特定生理效应开发药物。典型代表是诺氟沙星等一系列抗炎药、降压药等。第三个阶段是本世纪初，随着第一个小分子靶向抑制剂伊布替尼（格列卫）的诞生，根据明确的分子生物学机理，针对疾病人群所携带的基因突变（靶点）而筛选开发药物。自此，小分子药物开发真正进入靶向时代。

天然产物一直是新药研究的重要来源之一，在过去的三十年中，批准上市的61%抗癌药物和49%的抗感染药物都属于天然小分子药物及其衍生物，其中很多天然来源的药物能够同时作用于多种靶点、产生多种药效机制共同改善患者的身体状态，且和同领域药物相比具备更低的耐药性和毒性，更有利于患者的长期使用。随着合成技术和高通量筛选技术的发展，越来越多的具有生物活性的小分子被发掘，而针对小分子靶点进行的研究则有助于明确天然小分子治疗疾病的药效机制，使得天然小分子作为药物治疗疾病的潜力得到充分挖掘。

目前针对小分子靶点的鉴定方法总体上可分为两大类：一是基于标记法鉴定小分子作用靶点，二是基于非标记法鉴定小分子作用靶点。

基于标记法鉴定小分子作用靶点

亲和层析技术

亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。在实验过程中，将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂并和目标蛋白溶液进行孵育，通过特定层析柱进行洗脱，将结合物通过SDS-PAGE电泳进行分析，将目标蛋白染色后通过质谱进行检测。

此方法的优势在于它是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利；缺点在于除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误识别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系，且载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。

图 1 亲和层析技术流程图

小分子探针“钩钓”技术

小分子探针一般包括两部分，即反应基团和报告基团。反应基团是活性分子探针的核心，它决定了在蛋白质组学中与其反应的蛋白种类以及氨基酸残基。报告基团一般分为两种：一种是荧光基团（如罗丹明），可以通过胶内荧光实验分析靶标产生的荧光信号；另一种是生物素基团，可以与结合链霉素亲和素（Streptavidin）的琼脂糖珠进行富集后进行生物质谱分析，也就是目前常用的ABPP技术。

亲和垂钓是最早提出、也是最经典的靶点发现方法，广泛应用于目标蛋白的鉴定，并取得了良好的效果。然而，这种方法也有局限性，固定化可能会导致天然产物活性的改变，相互结合处的空间结构容易受到阻碍，因此难以找出与该空间结构有亲和力的蛋白质。这些局限性导致利用此法鉴定小分子体内的作用靶点存在一些不确定性。

基于SILAC标记识别技术

稳定同位素标记(Stable isotope labels,SIL)是利用非放射性的稳定同位素对代谢途径或体内发生的生化反应进行标记, 并与非放射性的普通同位素标记的组分进行比较分析, 确定相对含量变化。SILAC 技术即稳定同位素标记技术，是将正常培养的细胞，利用含有轻、重同位素型必需氨基酸的培养基分别进行细胞培养，细胞传代若干代后，细胞内蛋白被同位素稳定标记，将蛋白质等量混合后进行分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量。

该技术的优势在于与传统的Pull down和CoIP法相比，其方法的灵敏度更高、特异性更强。但是由于实验过程中需要进行多次传代，细胞培养周期长，成本高。

1.4 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮~5轮的"吸附-洗脱-扩增"后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。

噬菌体展示技术优势在于可以用于模拟表位的筛选，高通量筛选目标靶点，易于纯化；其不足在于所建的肽库容量只能达到109，要想构建大片段的肽库很困难，其次，需要解决肽库的多样性问题，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。作为一种新技术，类似的具体问题还很多。但这些暂时的缺点并不能掩盖其巨大应用潜力。

基于非标记法鉴定小分子作用靶点

药物亲和反应靶标稳定性分析（DARTS）

DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability）技术最初是由Lomenick等在2009年提出的，该技术利用启动子研究中题型的DNA结合位点与其相应的转录因子结合后具有抗DNase降解这一特性，推测药物与靶蛋白结合后可能使靶标蛋白具有抗蛋白酶水解的特性。通过联合使用液相色谱和质谱法，检测SDS-PAGE中的条带，从而实现靶蛋白的鉴定。

该方法的优势在于进行目标识别时不需要对小分子进行任何的化学修饰，从而避免了繁琐的有机合成和因化合物空间结构改变带来的生物活性丢失，可用于确定其直接结合的蛋白靶点。此外，由于实验步骤中不包括洗涤，DARTS可用于分析低亲和力物质之间的相互作用。但是，利用Western blotting或考马斯亮蓝染色来阐明配体与靶蛋白的相互作用过程中，当样品中目标蛋白丰度较低时，DARTS法不易将目标蛋白可视化。

蛋白质热稳定性分析（CETSA）

CETSA是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。即随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。利用此原理，结合质谱法可以同时检测全蛋白质组在多个温度下的热变性状态，并绘制完整的熔化曲线，从而可以确定每种蛋白质的热位移变化，这种技术被称为热蛋白质组学（TPP）。TPP可被用于细胞提取物或者是完整的活细胞层次研究，结合这两个方面的信息，可以区分靶蛋白直接与配体结合引起的热位移和下游信号通路变化引起的蛋白质热位移。其中在活细胞中热稳定性受到影响，但在细胞提取物中未受影响的蛋白质可能是药物的间接靶点。因为质谱方法的分析通量很高，可以一次性分析成千上万的蛋白，所以TPP方法适用于筛选一系列潜力药物或其他小分子的靶蛋白及其相互作用蛋白与下游信号通路的研究。

利用该方法可以检测配体与靶蛋白之间的相互作用，不需要任何额外的步骤即可利用完整细胞，是一种基于Western blotting和抗体对靶蛋白的高选择性的方法。适用于多种类型的蛋白质，但对于更大、更复杂的可溶性蛋白和膜蛋白的用途尚待确定。且该技术需要高浓度的药物，在发现新靶点的过程中明显通量不足，常被用于靶点的验证和确定。

氧化速率蛋白稳定性分析（SPROX）

SPROX也是利用配体诱导的蛋白质稳定性增强的原理建立的。该技术通过测定靶蛋白的甲硫氨酸(Met) 氧化的水平，利用配体诱导的热力学变化鉴定靶蛋白。其主要策略是，首先将蛋白质样品与药物或对照溶剂共孵育，在浓度越来越高的化学变性剂(如盐酸胍) 的存在下，加入氧化剂(如过氧化氢) 氧化甲硫氨酸形成甲硫氨酸亚砜(Met-O) 或甲硫氨酸砜(Met-O2)，随后淬灭氧化反应，胰酶消化成肽段后进行LC-MS/MS定量分析变性剂浓度依赖的甲硫氨酸的氧化速率，当以未氧化和氧化的含Met肽段的量为纵坐标，变性剂浓度为横坐标时，药物结合蛋白未氧化和氧化的含Met肽段的转变中点右移。

该技术的主要局限性是其通过检测和定量甲硫氨酸肽段氧化率来反应蛋白质热力学稳定性，而蛋白质中的甲硫氨酸的出现频率相对较低(约2.5%)。由于该技术只能检测含有甲硫氨酸的蛋白质与小分子的结合，但并不是所有的甲氨酸残基都表现出不同的氧化速率，因此不能完全确证蛋白质和配体相互作用。

参考文献

李瑞梅,程瑶,朱朱等.中药有效成分直接作用靶点的鉴定方法及应用[J].世界科学技术-中医药现代化,2021,23(01):1-6.

陈树强,董国强,盛春泉等.活性小分子化合物靶点验证方法的研究进展[J].药学实践杂志,2016,34(02):97-102.

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梁例汪13514049279 ______ 我知道的有硅胶和氧化铝两种

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计彩霭1436怎样装层析柱才不会有气泡? -
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