氧解离曲线图影响因素

实验目的

琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

实验原理

   琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品其中有三种构型的分子共价闭合环状的超螺旋分子cccDNA、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA

    核酸分子是两性解离分子pH3.5是碱基上的氨基解离而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离所以分子带正电在电场中向负极泳动而pH8.0-8.3时碱基几乎不解离而磷酸基团解离所以核酸分子带负电在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言电荷密度愈大泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说分子量的常用对数与泳动率成反比用此标准样品电泳并测定其泳动率然后进行DNA分子长度bp的负对数——泳动距离作标准曲线图可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大比如质粒分子泳动率的大小顺序为cDNAIDNAocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响会出现相反的情况。

2、支持物介质

核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺Acr在N,N,N′-四甲基乙四胺TEMED和过硫酸铵AP的催化下聚合形成长链并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺Bis交叉连接而成其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。

琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段5bp-500bp的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA分子。

3、电场强度

电场强度愈大带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小所以电泳时一般采用低电压不超过4V/cm。而对于大片段电泳甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

4、缓冲液离子强度

核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统但它们各有利弊。TAE价格低廉但缓冲能力低必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时会使DNA污染磷酸盐影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。

在缓冲液中加入EDTA可以鳌合二价离子抑制DNase保护DNA。

缓冲液pH常偏碱性或中性此时核酸分子带负电向正极移动。

核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭ethidium bromide EB。溴化乙锭是一种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时出现不同的效应。254nm的紫外线照射时灵敏度最高但对DNA损伤严重360nm紫外线照射时虽然灵敏度较低但对DNA损伤小所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高且对DNA损伤不是很大所以也比较适用。

使用溴化乙锭对DNA样品进行染色可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况但是如果要测定核酸分子大小时不宜使用以上方法而是应该在电泳结束后把凝胶浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中1030min进行染色。BE见光分解应在避光条件下4℃保存。

材料、试剂及器具

1、材料

1kbMarker分子量标准DNA样品

2、试剂

加样缓冲液6x0.25%溴酚兰40%蔗糖琼脂糖溴化乙锭EB酶液10mg/ml。

3、器具

1电泳系统电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。

2紫外透射仪。

操作步骤

1、按所分离的DNA分子的大小范围称取适量的琼脂糖粉末放到一锥形瓶中加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化溶液透明。稍摇匀得胶液。冷却至60℃左右在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。 

2、取有机玻璃制胶板槽有透明胶带沿胶槽四周封严并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。

3、水平放置胶槽在一端插好梳子在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液使之形成均匀水平的胶面。

4、.待胶凝固后小心拔起梳子撕下透明胶带使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

5、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖过胶面

6、把待检测的样品按以下量在洁净载玻片上小心混匀用移液枪加至凝胶的加样孔中。

1μl加样缓冲液6×+5μl待测DNA样品

〔+0.5μlEB液10mg/ml注若胶内未加EB可选用此法。〕

7、接通电泳仪和电泳槽并接通电源调节稳压输出电压最高不超过5V/cm开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

8、观察溴酚兰的带蓝色的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处可停止电泳。

9、染色把胶槽取出小心滑出胶块水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上放进EB溶液中进行染色完全浸泡约30min。

10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜赶去气泡平铺然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门打开紫外灯360nm或254nm通过观察孔进行观察。

注意事项

1、电泳中使用的溴化乙锭EB为中度毒性、强致癌性物质务必小心勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作戴一次性手套并及时更换。

2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB染色步骤可省略若凝胶放置一段时间后才观察即使原来胶内或样品已加EB也建议增加此步。

3、加样进胶时不要形成气泡需在凝胶液未凝固之前及时清除否则需重新制胶。

4、以0.5×TBE作为电泳缓冲液时溴酚兰在0.5%1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度而二甲苯青FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。

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