细胞培养的过程与步骤

悬浮细胞培养法: 以淋巴细胞为例

​根据血液中各种细胞的比重不同，在血液中加入淋巴细胞分离液，通过离心法，可是一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布，通常会分为4层，从上至下依次为血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层（见图1）。

具体步骤：

1）抽取静脉血2 mL，注含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2 mL Hanks溶液稀释；

2）吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1）；

3）水平式离心2000 r/min×20 min；

4）用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500 r/min×10 min；

5）弃上清，加RPMI-1640培养液1 mL混匀，取少许进行细胞计数及活力测定；

6）贴壁法区分单核细胞（易贴壁）和淋巴细胞。

注意事项：

1）血液样本须在抽取2小时内使用；

2）注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上，避免破坏其界面；

3）在收集单核细胞和淋巴细胞时，将吸管轻轻插入该层后，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。

图1血液中不同比重的细胞分层示意图

组织块培养法：以大鼠肺成纤维细胞为例

具体步骤：​

1）铺瓶：乳大鼠经颈动脉放血后，无菌操作取肺脏组织，置于含Hanks液的平皿中漂洗3次，将血凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，将肺脏组织剪成约1 mm2大小碎片，均匀铺在瓶底，25 mL培养瓶可接种20~30小块；

2）轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内；待其稍干燥后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养；

3）培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，在第7-9天便开始有细胞从组织块周围爬出。

图3  第14天左右细胞融合成大片

消化法：以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为例

具体步骤：

1）无菌条件下取正常分娩胎儿的新鲜脐带，用PBS冲洗脐带至无血色液体流出。

2）从脐静脉一端注入0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液，夹闭脐带两端，置于37℃培养箱中进行消化。15 min后，收集消化液，并加入含20％胎牛血清的M199培养基终止消化，注入M199培养基反复灌洗脐带，收集冲洗液，与消化液一起1000 rpm离心5 min；

3）弃上清液，加入M199培养液（含20%胎牛血清、100 ng/ml VEGF），吹打，使细胞重悬，移入培养瓶中，静置培养；

4）24 h后换液，以后每隔3天换液一次，约7天左右细胞长满汇合，可以传代；

5）使用前可使用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。

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