质粒一般如何保存

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调 pH），氨苄青霉素，卡那 霉素，质粒提取试剂盒 

仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒 1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：

1.  LB 培养基的配制：

在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇 动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 15psi 高 压下蒸汽灭菌 20min.

固态培养基

LB 固体培养基及倒板 ：

（1）.配制：100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉

（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55℃的水浴中，待培 养基温度降到 55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为 50μg/ml），以免温度过 高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于 4℃保存，一个月内使用。

2.  从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

3.  加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30分钟后。

4.  42℃水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。

5. 向管中加入 1ml LB 液体培养基（不含 Amp），混匀后 37℃振荡培养 1 小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。

6. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌 液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养 16-24 小时。

同时做两个对照：

对照组 1： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情 况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

对照组 2： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不 含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

大肠杆菌的扩增

1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3-5ml LB 液体培养基中，37℃下振荡 培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1：100-1：50 的比例接种 于 100ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 ＝0.5 左右。

2.  取上述培养液置于冰中 10min，之后转移到已灭菌的 50ml 离心管中再于冰上放置5min

3.  于 4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌

4.   质粒的提取

准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

5.   质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）

质粒转染细胞株

材料

细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA 消化液、转染试剂（Lipofectamine  TM2000）

实验步骤

Ⅰ.准备细胞：

贴壁细胞：转染前 24 h，在 500 µL 无双抗完全培养基中接种 0.5-2×105 个细胞， 转染时细胞融合度为 80 - 90% 。 ( 注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞 堆积生长。)

II  ．对于每个转染样品，按下面的方法准备：

（1）用 50 µL Opti-MEM 稀释 0.8 µg 质粒 DNA，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下 静置 5 min。

（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 µL Opti-MEM  稀释 2.0 µL   LipofectamineTM2000，轻轻吹吸 3 - 5  次混匀，室温下静置 5  min。

（3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100  µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5）将细胞板置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右。 稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）

从 37℃，5％CO2 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 µg/ml G418 的 新鲜培养基，每  2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到 60%汇合率时再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选一次。当细胞达到 90%以上汇合率时将细 胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10-12 天左右）。以后每隔 4-5 天再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染 后 15 天左右）。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

冉常全2992请问重组质粒做成固体,多少度保存 -
屠星具19291369964 ______ 干粉啊,短期常温保存就行,长期-20℃保存

冉常全2992大肠杆菌离心后在常温下放了一天,还能用来抽提质粒trail吗,要用来做动 -
屠星具19291369964 ______ 大肠杆菌常温放置会导致质粒降解,但短时间比如1-3天问题不大,而且一天只会导致大肠杆菌因为缺乏营养而停止生长,可以用来抽提质粒.超过三天会开始降解,一周后明显降解.质粒在4度可放置数个月,-20保存数年. 菌液一般放在-80度...

冉常全2992我从国外要回来的质粒,刚到,是点在滤纸上的,我把滤纸直接放在 - 20保存了,这样能永久保存吗? -
屠星具19291369964 ______ -20是不可能“永久”的.就我保存质粒的经验,提出的质粒(水溶液)在-20一年后还是能转出的. 你目前得到的是滤纸,也不知道别人给你点质粒时无菌条件如何,也不知道运输过程是否折腾.估计,你放-20一周至一个月是应该还可以转出来. 但既然这个质粒这么难得和重要,为什么不赶紧做转化,摇菌提质粒呢?

冉常全2992质粒DNA可否在无水乙醇中于 - 20摄氏度长期保存? -
屠星具19291369964 ______ 没见过这么保存的,而且无水乙醇挥发的,怎么能长期保存呢.

冉常全2992质粒 - 20度存储四个月,对测序结果有影响吗 -
屠星具19291369964 ______ 没有影响,一般的质粒浓度都很高,用试剂盒提取得到的质粒大概有1ng/ul,因此对测序完全没有影响,你只要送个5ul给测序公司就够了.

冉常全2992质粒DNA为何保存在TE缓冲液中
屠星具19291369964 ______ TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液:其中比较关键的成分是EDTA,日常环境中不可避免的存在DNase,而DNase的活性依赖于钙离子,并能被镁离子或二价锰离子激活.镁离子存在条件下,DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下,DNase I可在同一位点剪切DNA双链,形成平末端,或1-2个核苷酸突出的粘末端.TE中含有的EDTA可以螯合金属离子,从而使DNase失活.而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值,有助于DNA的溶解和稳定.一般长期保存需要TE缓冲液比较好,短期应用的可以使用ddH2O,有助于DNA连接等效果.

冉常全2992传统法提取质粒中溶液二能冰置吗? -
屠星具19291369964 ______ 不需也不能 冰置:不需:溶液2主要是NaOH和SDS,也不会有Rnase等活性成分,这是用来裂解菌体的,不需冰置;不能:SDS在温度较低时会呈絮状沉淀析出,需水浴溶解后,溶液2才能使用,否则会影响质粒纯度.所以,使用溶液2,你需要关心的是:1、使用前检查有无沉淀(室温低于15℃时尤其注意),若有,水浴加热;2、每次使用完,拧紧,防止NaOH与空气中的CO2反应;3、溶液2室温保存,不要放冰箱,否则就会有沉淀.个人见解,仅供参考,祝愉快!

冉常全2992他人赠送的质粒电泳能跑出条带吗? -
屠星具19291369964 ______ 降解也会有条带 你确定不是你电泳方法有问题?质粒即使浓度低 也能看到 反正就在你溶解和跑电泳这两步有错误了

冉常全2992提质粒的溶液一忘了放回四度冰箱怎么办? -
屠星具19291369964 ______ 没问题,缓冲液一般都是一些无机盐成分,不那么容易降解的,你就是反正该室温下一个星期也没问题,但是酶最好不要忘了放在低温或常温,虽然在4度一天不至于失活,但酶活力会下降很多的

冉常全2992质粒DNA提取中为什么要用冰预冷溶液I和溶液Ⅲ? -
屠星具19291369964 ______ 溶液I里面有RNAse,常温下容易失活,所以一般冷藏储存保持活性; 溶液III不需要预冷吧……